Κανονισμός 2568/1991

Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 της Επιτροπής της 11ης Ιουλίου 1991 σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και με τις μεθόδους προσδιορισμού.

11 Ιουλίου 1991

Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθημα τεκμηρίωσης και δεν δεσμεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 11ης Ιουλίου 1991
σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς
και με τις μεθόδους προσδιορισμού
(EE L 248 της 5.9.1991, σ. 1)
Τροποποιείται από:
Επίσημη Εφημερίδα
αριθ. σελίδα ημερομηνία
►M1 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 3682/91 της Επιτροπής της 17ης Δεκεμβρίου
L 349 36 18.12.1991
►M2 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1429/92 της Επιτροπής της 26ης Μαΐου 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1683/92 της Επιτροπής της 29ης Ιουνίου
L 176 27 30.6.1992
►M4 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1996/92 της Επιτροπής της 15ης Ιουλίου
L 199 18 18.7.1992
►M5 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 3288/92 της Επιτροπής της 12ης Νοεμβρίου
L 327 28 13.11.1992
►M6 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 183/93 της Επιτροπής της 29ης Ιανουαρίου
L 22 58 30.1.1993
►M7 τροποποιείται από Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 826/93 της Επιτροπής της
6ης Απριλίου 1993
L 87 6 7.4.1993
►M8 Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 620/93 της Επιτροπής της 17ης Μαρτίου
L 66 29 18.3.1993
►M9 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 177/94 της Επιτροπής της 28ης Ιανουαρίου
L 24 33 29.1.1994
►M10 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2632/94 της Επιτροπής της 28ης Οκτωβρίου
L 280 43 29.10.1994
►M11 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 656/95 της Επιτροπής της 28ης Μαρτίου 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2527/95 της Επιτροπής της 27ης Οκτωβρίου
L 258 49 28.10.1995
►M13 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2472/97 της Επιτροπής της 11ης Δεκεμβρίου
L 341 25 12.12.1997
►M14 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 282/98 της Επιτροπής της 3ης Φεβρουαρίου
L 28 5 4.2.1998
►M15 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2248/98 της Επιτροπής της 19ης Οκτωβρίου
L 282 55 20.10.1998
►M16 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 379/1999 της Επιτροπής της 19ης Φεβρουαρίου
L 46 15 20.2.1999
►M17 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 455/2001 της Επιτροπής της 6ης Μαρτίου 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2042/2001 της Επιτροπής της 18ης Οκτωβρίου
L 276 8 19.10.2001
►M19 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 796/2002 της Επιτροπής της 6ης Μαΐου 2002 L 128 8 15.5.2002
►M20 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1989/2003 της Επιτροπής της 6ης Νοεμβρίου
L 295 57 13.11.2003
►M21 Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 702/2007 της Επιτροπής της 21ης Ιουνίου 2007 L 161 11 22.6.2007
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 1
Διορθώνεται από:
►C1 Διορθωτικό ΕΕ L 108 της 25.4.1992, σ. 57 (91/2568)
►C2 Διορθωτικό ΕΕ L 176 της 20.7.1993, σ. 26 (93/183)
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 2
ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 11ης Ιουλίου 1991
σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των
ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και με τις μεθόδους
προσδιορισμού
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,
τον κανονισμό αριθ. 136/66/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 22ας Σεπτεμ-
βρίου 1966 περί δημουργίας κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα
των λιπαρών ουσιών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανο-
νισμό (ΕΟΚ) αριθ. 3577/90 (2), και ιδίως το άρθρο 35α,
Εκτιμώντας:
ότι στο παράρτημα του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ προβλέπονται η
περιγραφή και ο ορισμός των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων που
διατίθενται στο εμπόριο στο εσωτερικό κάθε κράτους μέλους, καθώς
και όσον αφορά τις ενδοκοινοτικές συναλλαγές και τις συναλλαγές με
τις τρίτες χώρες·
ότι, για να καταστεί δυνατός ο διαχωρισμός μεταξύ των διαφόρων
τύπων ελαίου, θα πρέπει να καθοριστούν τα φυσικοχημικά χαρακτηρι-
στικά κάθε ελαίου, καθώς και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των
παρθένων ελαίων, κατά τρόπο που να διασφολίζεται η γνησιότητα και η
ποιότητα των εν λόγω προϊόντων, με την επιφύλαξη των υπολοίπων
διατάξεων, οι οποίες αφορούν αυτό το θέμα·
ότι θα πρέπει να προσδιοριστούν κατά ενιαίο τρόπο σε ολόκληρη την
Κοινότητα τα χαρακτηριστικά των διαφόρων τύπων ελαίου· ότι, προς το
σκοπό αυτό, θα πρέπει να καθοριστούν οι μέθοδοι, χημικής ανάλυσης
και οργανοληπτικής αξιολόγησης στην Κοινότητα· ότι θα πρέπει, εντού-
τοις, να επιτραπεί κατά τη διάρκεια μεταβατικής περιόδου η χρησιμο-
ποίηση άλλων μεθόδων ανάλυσης που εφαρμόζονται στα κράτη μέλη,
προβλέποντας παράλληλα ότι, σε περίπτωση που τα αποτελέσματα
παρουσιάζουν διαφορές, θα είναι καθοριστικά τα αποτελέσματα που
έχουν ληφθεί με βάση την ενιαία μέθοδο·
ότι ο προσδιορισμός των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του ελαιο-
λάδου και των μεθόδων ανάλυσης οδηγεί στην προσαρμογή των συμ-
πληρωματικών επεξηγήσεων του κεφαλαίου 15 της συνδυασμένης ονο-
ματολογίας·
ότι στην μέθοδο αξιολόγησης των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών
των παρθένων ελαίων περιλαμβάνεται η συγκρότηση ομάδος δοκιμα-
στών που έχουν επιλεγεί και εξασκηθεί ειδικά γι' αυτό· ότι είναι, επο-
μένως, σκόπιμο να προβλεφθεί η προθεσμία η αναγκαία για την
δημιουργία μιας τέτοιας υποδομής· ότι, λαμβανομένων υπόψη των
δυσκολιών που θα συναντήσουν ορισμένα κράτη μέλη για την συγκρό-
τηση ομάδων δοκιμαστών, είναι σκόπιμο να δοθεί άδεια να καταφεύ-
γουν στις υπάρχουσες ομάδες άλλων κρατών μελλών·
ότι, για να εξασφαλιστεί η ορθή λειτουργία του συστήματος των εισ-
φορών που εφαρμόζονται κατά την εισαγωγή των ελαιοπυρήνων είναι
σκόπιμο να προβλεφθεί μια ενιαία μέθοδος για τον καθορισμό της
περιεκτικότητας σε έλαιο των εν λόγω προϊόντων·
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 3
(1) ΕΕ αριθ. L 172 της 30. 9. 1966, σ. 3025/66.
(2) ΕΕ αριθ. L 353 της 17. 12. 1990, σ. 23.
ότι, για να μην προκληθεί ζημιά στο εμπόριο, είναι σκόπιμο να προ-
βλεφθεί μια περιορισμένη περίοδος για την διάθεση του τυποποιημένου
ελαιολάδου πρό της ενάρξεως του παρόντος κανονισμού·
ότι είναι σκόπιμο να καταργηθεί ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 της
Επιτροπής (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό
(ΕΟΚ) αριθ. 1858/88 (2)·
ότι η Επιτροπή Διαχείρισης Λιπαρών Ουσιών δεν διατύπωσε γνώμη
εντός της ταχθείσας προδεσμίας,
ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:
▼M20
Άρθρο 1
1. Θεωρούνται παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του σημείου 1
α) και β) του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, τα
ελαιόλαδα των οποίων τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα
που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημεία 1 και 2 του παρόντος κανο-
νισμού.
2. Θεωρείται ελαιόλαδο λαμπάντε, κατά την έννοια του σημείου 1 γ)
του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο
του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρο-
νται στο παράρτημα Ι σημείο 3 του παρόντος κανονισμού.
3. Θεωρείται εξευγενισμένο ελαιόλαδο, κατά την έννοια του σημείου
2 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο
του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρο-
νται στο παράρτημα Ι σημείο 4 του παρόντος κανονισμού.
4. Θεωρείται ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένο ελαιόλαδο
και παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του σημείου 3 του παραρτή-
ματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα
χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρ-
τημα Ι σημείο 5 του παρόντος κανονισμού.
5. Θεωρείται ακατέργαστο πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σημείου
4 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του
οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται
στο παράρτημα Ι σημείο 6 του παρόντος κανονισμού.
6. Θεωρείται εξευγενισμένο πυρηνέλαιο, κατά την έννοια του
σημείου 5 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το
έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που
αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 7 του παρόντος κανονισμού.
7. Θεωρείται πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σημείου 6 του παραρ-
τήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα
χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρ-
τημα Ι σημείο 8 του παρόντος κανονισμού.
▼B
Άρθρο 2
1. Ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών των ελαίων που προβλέ-
πονται στο παράρτημα I του παρόντος κανονισμού πραγματοποιείται
σύμφωνα με τις εξής μεθόδους ανάλυσης:
— για τον προσδιορισμό των ελευθέρων λιπαρών οξέων, εκπεφρασμέ-
νων σε ποσοστό ελαϊκού οξέος, η μέθοδος που αναφέρεται στο
παράρτημα II,
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 4
(1) ΕΕ αριθ. L 128 της 24. 5. 1977, σ. 6.
(2) ΕΕ αριθ. L 166 της 1. 7. 1988, σ. 10.
— για τον προσδιορισμό του αριθμού υπεροξειδίων, η μέθοδος που
αναφέρεται στο παράρτημα III,
▼M19
— για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε κηρούς, η μέθοδος
που αναφέρεται στο παράρτημα IV,
▼B
— για τον προσδιορισμό των στερολών, η μέθοδος που αναφέρεται στο
παράρτημα V,
— για τον προσδιορισμό της ερυθροδιόλης, η μέθοδος που αναφέρεται
στο παράρτημα VI,
▼M21
— για τον προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας 2-μονοπαλμιτί-
νης, η μέθοδος που αναφέρεται στο παράρτημα VII,
▼M20 __________
▼B
— για την φασματοφωτομετρική ανάλυση, η μέθοδος που αναφέρεται
στο παράρτημα IX,
— για τον προσδιορισμό της συνθέσεως των λιπαρών οξέων, η μέθο-
δος που αναφέρεται στα παραρτήματα Α και Β.
— για τον προσδιορισμό των αλογονομένων πτητικών υδρογονανθρά-
κων, η μέθοδος που αναφέρεται στο παράρτημα XI,
— για την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρ-
θένων ελαιολάδων, η μέθοδος που αναφέρεται στο παράρτημα XII,
που εφαρμόζεται σύμφωνα με την παράγραφο 2,
▼M20
__________
▼M11
— για τον προσδιορισμό των στιγμασταδιενίων, η μέθοδος που αναφέ-
ρεται στο παράρτημα XVII,
▼M13
— για τον προσδιορισμό της συνθέσεως των τριγλυκεριδίων σε
ECN42, η μέθοδος που αναφέρεται στο παράρτημα XVIII,
▼M19
— για τον προσδιορισμό του περιεχομένου σε αλειφατικές αλκοόλες, η
μέθοδος που αναφέρεται στο παράρτημα XIX.
2. Η εκτίμηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων
ελαιολάδων από τις εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώπους τους πραγμα-
τοποιείται από ομάδες δοκιμαστών αναγνωρισμένες από τα κράτη μέλη.
Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά ενός ελαιολάδου που αναφέρονται
στο πρώτο εδάφιο θεωρούνται σύμφωνα με τη δηλούμενη κατηγορία
του ελαιολάδου αν η αναγνωρισμένη από το υπόψη κράτος μέλος
ομάδα επιβεβαιώσει τη συγκεκριμένη κατάταξη.
Στην περίπτωση που η αναγνωρισμένη ομάδα δεν επιβεβαιώσει τη
δήλωση σε ό,τι αφορά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά της κατηγο-
ρίας του δηλωθέντος ελαιολάδου, οι εθνικές αρχές ή οι αντιπρόπωποί
τους διενεργούν ύστερα από αίτηση του ενδιαφερομένου δύο κατ'
έφεση αναλύσεις από άλλες αναγνωρισμένες ομάδες, από τις οποίες η
μία τουλάχιστον πραγματοποιείται από ομάδα αναγνωρισμένη από το
κράτος μέλος παραγωγής του ελαιολάδου. Τα υπόψη χαρακτηριστικά
θεωρούνται σύμφωνα με τα δηλωθέντα αν οι δύο κατ' έφεση αναλύσεις
επιβεβαιώσουν τη συγκεκριμένη κατάταξη. Σε αντίθετη περίπτωση τα
έξοδα των κατέφεση αναλύσεων, με την επιφύλαξη των κυρώσεων που
έχουν επιβληθεί, καταλογίζονται στον ενδιαφερόμενο.
▼M17
3. Όσον αφορά τους ελέγχους που διενεργούνται από τις εθνικές
αρχές ή τους αντιπροσώπους τους για τον προσδιορισμό των χαρακτη-
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 5
ριστικών των ελαίων που προβλέπονται στην παράγραφο 1, η δειγμα-
τοληψία διενεργείται σύμφωνα με τις διεθνείς προδιαγραφές EN ISO
661 και EN ISO 5555 σχετικά με την προετοιμασία δείγματος υποβαλ-
λόμενου σε δοκιμή και με τη δειγματοληψία. Ωστόσο, κατά παρέκκλ-
λιση από το σημείο 6.8 της προδιαγραφής EN ISO 5555, για τις παρ-
τίδες που αποτελούνται από τα εν λόγω έλαια, σε άμεσες συσκευασίες
μικρότερες ή ίσες από 100 λίτρα, η δειγματοληψία διενεργείται σύμ-
φωνα με το παράρτημα Ια του παρόντος κανονισμού.
▼M19
Με την επιφύλαξη των διατάξεων της προδιαγραφής EN ISO 5555 και
του κεφαλαίου 6 της προδιαγραφής EN ISO 661, τα δείγματα προφυ-
λάσσονται από το φως και από υψηλές θερμοκρασίες το ταχύτερο
δυνατό και αποστέλλονται στο εργαστήριο για τις αναλύσεις το αργό-
τερο:
— τη δέκατη εργάσιμη ημέρα ύστερα από εκείνη της λήψης, κατά τους
μήνες Οκτώβριο έως Μάιο και
— την πέμπτη εργάσιμη ημέρα ύστερα από εκείνη της λήψης, κατά
τους μήνες από Ιούνιο έως Σεπτέμβριο.
▼M17
4. ►M20 Για τους ελέγχους που προβλέπονται στην παράγραφο 3,
οι αναλύσεις που αναφέρονται στα παραρτήματα II, III, IX, X και XII,
καθώς και, ενδεχομένως, οι κατ' αντιπαράθεση αναλύσεις που προβλέ-
πονται από τις εθνικές νομοθεσίες διεξάγονται πριν από την ημερομηνία
ελάχιστης διατηρησιμότητας. Στην περίπτωση που η δειγματοληψία
πραγματοποιείται άνω των τεσσάρων μηνών πριν από την ημερομηνία
ελάχιστης διατηρησιμότητας, οι εν λόγω αναλύσεις πρέπει να πραγμα-
τοποιούνται το αργότερο τον τέταρτο μήνα που ακολουθεί τον μήνα της
δειγματοληψίας. Δεν εφαρμόζεται καμία αναβολή για τις άλλες αναλύ-
σεις που προβλέπονται από τον εν λόγω κανονισμό. ◄
Εκτός εάν η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε κάτω του ενός μηνός
πριν από την ημερομηνία της ελάχιστης διατηρησιμότητας, στην περί-
πτωση κατά την οποία τα αποτελέσματα των αναλύσεων δεν αντιστοι-
χούν στα χαρακτηριστικά της κατηγορίας του ελαιόλαδου ή του πυρη-
νελαίου που δηλώθηκε, ο ενδιαφερόμενος ενημερώνεται το αργότερο
ένα μήνα πριν από τη λήξη της προθεσμίας που αναφέρεται στο πρώτο
εδάφιο.
▼M19
5. Ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων πραγμα-
τοποιείται με τις μεθόδους που προβλέπονται στην παράγραφο 1, και τα
αποτελέσματα των αναλύσεων συγκρίνονται απευθείας με τα όρια που
προβλέπονται από τον παρόντα κανονισμό.
▼M20
Άρθρο 2α
Ο έλεγχος, εκ μέρους των αρμοδίων αρχών ή των αντιπροσώπων τους,
της συμφωνίας ενός δείγματος ελαιολάδου ή πυρηνελαίου με τη δηλω-
θείσα κατηγορία δύναται να πραγματοποιηθεί:
α) είτε με τη διεξαγωγή των αναλύσεων που προβλέπονται στο παράρ-
τημα Ι, ανεξαρτήτως σειράς·
β) είτε σύμφωνα με τη σειρά που προβλέπεται στο παράρτημα Ιβ σχε-
τικά με το διάγραμμα αποφάσεων, μέχρι να υπάρξει κατάληξη σε
μία από τις αποφάσεις που αναφέρονται από το εν λόγω διάγραμμα.
▼M19
__________
▼M5
Άρθρο ►M19 3 ◄
Στην περίπτωση που διαπιστώνεται ότι τα οργανοληπτικά χαρακτηρι-
στικά ενός ελαιολάδου διαφέρουν από εκείνα που προκύπτουν από την
▼M17
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 6
ονομασία του, το ενδιαφερόμενο κράτος μέλος επιβάλλει, με την επι-
φύλαξη άλλων ενδεχομένων κυρώσεων, διοικητικές χρηματικές ποινές,
το ποσό των οποίων καθορίζεται ανάλογα με την σοβαρότητα της δια-
πιστωθείσας παρατυπίας.
Για την αξιολόγηση της παρατυπίας αυτής, λαμβάνεται υπόψη η φυσική
εξέλιξη των χαρακτηριστικών ενός ελαιολάδου που διατηρείται υπό
κανονικές συνθήκες.
Τα κράτη μέλη ενημερώνουν την Επιτροπή, στην αρχή κάθε εξαμήνου,
για τον αριθμό και τη φύση των διαπιστωθεισών παρατυπιών καθώς και
τις κυρώσεις που επέβαλαν στη διάρκεια του προηγούμενου εξαμήνου.
Άρθρο 4
▼M19
1. Για την εκτίμηση και τον έλεγχο από τις αρμόδιες αρχές ή τον
εκπρόσωπό τους των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, τα κράτη μέλη
δύνανται να αναγνωρίζουν ομάδες δοκιμαστών.
Οι όροι αναγνώρισης καθορίζονται από τα κράτη μέλη έτσι, κυρίως,
ώστε:
— να ανταποκρίνονται στους όρους του παραρτήματος XII σημείο 4,
— να διασφαλίζεται ότι η κατάρτιση του επικεφαλής της ομάδας πραγ-
ματοποιείται από ίδρυμα και υπό προϋποθέσεις αναγνωρισμένες για
το σκοπό αυτό από το κράτος μέλος,
— η εγκυρότητα των λαμβανόμενων αποτελεσμάτων των εξετάσεων να
υπόκειται σε σύστημα ετήσιου ελέγχου διαμορφωμένο από το κρά-
τος μέλος.
Κάθε κράτος μέλος κοινοποιεί στην Επιτροπή κατάλογο των αναγνωρι-
σμένων ομάδων καθώς και τα μέτρα που ελήφθησαν σύμφωνα με την
παρούσα παράγραφο.
▼M5
2. Στην περίπτωση που ένα κράτος αντιμετωπίζει δυσκολίες για να
συγκροτήσει επιτροπή δοκιμαστών στην επικράτειά του, μπορεί να προ-
σφύγει σε αναγνωρισμένη επιτροπή δοκιμαστών σε ένα άλλο κράτος
μέλος.
3. Κάθε κράτος μέλος καθορίζει τον κατάλογο των επιτροπών δοκι-
μαστών που συγκροτούνται από τις επαγγελματικές ή διεπαγγελματικές
οργανώσεις σύμφωνα με τους όρους που περιγράφονται στην παρά-
γραφο 1 και μεριμνά για την τήρηση των όρων αυτών.
▼M19
__________
▼B
Άρθρο 6
1. Η περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων και των άλλων
υπολειμμάτων εκχύλισης του ελαιολάδου (κωδικός ΣΟ 2306 90 11 και
2306 90 19) προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο
παράρτημα XV.
2. Η περιεκτικότητα σε έλαιο που αναφέρεται στην παράγραφο 1
είναι εκπεφρασμένη επί του 3 % κατά βάρος επί ξηράς ουσίας.
▼M20
Άρθρο 7
Εφαρμόζονται οι κοινοτικές διατάξεις όσον αφορά την παρουσία επι-
μολυντών.
▼M5
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 7
Όσον αφορά την περιεκτικότητα σε αλογονωμένους διαλύτες τα όρια
για όλες τις κατηγορίες ελαιολάδου είναι τα ακόλουθα:
— ανώτατη περιεκτικότητα κάθε αλογονωμένου διαλύτη που έχει ανι-
χνευθεί 0,1 mg/kg,
— ανώτατη συνολική περιεκτικότητα των αλογονωμένων διαλυτών που
έχουν ανιχνευθεί 0,2 mg/kg.
▼B
Άρθρο 8
1. Τα κράτη μέλη ανακοινώνουν στην Επιτροπή τα μέτρα που έχουν
λάβει για την εφαρμογή του παρόντος κανονισμού.
2. Τα κράτη μέλη κοινοποιούν στην Επιτροπή, στην αρχή κάθε εξα-
μήνου τα αποτελέσματα των αναλύσεων που πραγματοποιήθηκαν κατά
το προηγούμενο εξάμηνο.
Τα αποτελέσματα αυτά εξετάζονται από την Επιτροπή Διαχείρισης
Λιπαρών Ουσιών σύμφωνα με τη διαδικασία που προβλέπεται από το
άρθρο 39 του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ.
Άρθρο 9
Ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 καταργείται.
Άρθρο 10
1. Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη
δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτή-
των.
Η εφαρμογή της μεθόδου του παραρτήματος XII αρχίζει από την
►M1 1η Νοεμβρίου 1992 ◄, εξαιρουμένων των διαδικασιών των
σχετικών με την παρέμβαση.
▼M5
Η μέθοδος αυτή δεν εφαρμόζεται στα παρθένα ελαιόλαδα που συσκευά-
ζονται πριν από την 1η Νοεμβρίου 1992.
▼B
2. Ο παρών κανονισμός δεν ισχύει για τα ελαιόλαδα και τα πυρηνέ-
λαια που συσκευάστηκαν έως την ημερομηνία έναρξης ισχύος του
παρόντος κανονισμού και τέθηκαν στο εμπόριο έως τις 31 Οκτωβρίου
1992.
Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και
ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 8
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ
Σύνοψη
Παράρτημα I: Χαρακτηριστικά των ελαιολάδων
Παράρτημα Ια: Δειγματοληψία των παρτίδων ελαιόλαδου ή πυρηνελαίου
ελιών σε άμεσες συσκευασίες των 100 λίτρων κατ' ανώ-
τατο όριο
Παράρτημα Ιβ: Διάγραμμα αποφάσεων
Παράρτημα II: ►M21 Προσδιορισμός των ελευθέρων λιπαρών οξέων,
εν ψυχρώ μέθοδος◄
Παράρτημα III: Προσδιορισμός του αριθμού υπεροξειδίων
Παράρτημα IV: ►M6 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε κηρούς
διά χρωματογραφίας αερίου φάσεως με τριχοειδή
στήλη◄
Παράρτημα V: Προσδιορισμός της σύνθεσης και του περιεχομένου των
στερολών δι' αερίου χρωματογραφίας με τριχοειδή στήλη
Παράρτημα VI: Προσδιορισμός ερυθροδιόλης και ουβαόλης
Παράρτημα VII: ►M21 Προσδιορισμός της εκατοστιαίας αναλογίας 2-
μονοπαλμιτίνης◄
Παράρτημα VIII: Προσδιορισμός περιεκτικότητας τριγλυκερίδιων
Παράρτημα IX: Φασματοφωτομετρική ανάλυσις στο υπεριώδες
Παράρτημα XA: Ανάλυση μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων δι' αερίου χρω-
ματογραφίας
Παράρτημα XB: Παρασκευή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων σύμφωνα με
το παράρτημα VI, σημεία I και II του κανονισμού (ΕΟΚ)
αριθ. 72/77 ή σύμφωνα με τη μέδοδο που περιγράφεται
κατωτέρω
Παράρτημα XI: Προσδιορισμός της περιεκτικότητας του ελαιολάδου σε
αλογονούχους πτητικούς διαλύτες
Παράρτημα XII: Οργανοληπτική αξιολόγηση του παρθένου ελαιολάδου
Παράρτημα XIII: ►M6 Εξουδετέρωση και αποχρωματισμός του ελαιολά-
δου στο εργαστήριο◄
Παράρτημα XIV: Συμπληρωματικές σημειώσεις 2,3 και 4 του κεφαλαίου
15 της συνδυασμένης ονοματολογίας
Παράρτημα XV: Περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων
Παράρτημα XVI: Προσδιορισμός του αριθμού ιωδίου
Παράρτημα XVII: Μέθοδος προσδιορισμού των στιγμασταδιενίων στα
φυτικά έλαια
Παράρτημα XVIII: Μέθοδος προσδιορισμού της σύστασης τριγλυκερίδιων
σε ECN42
Παράρτημα XIX: Μέθοδος προσδιορισμού του περιεχομένου σε αλειφατι-
κές αλκοόλες
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 9
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 10
Π
Α
Ρ
Α
Ρ
Τ
Η
Μ
Α
I
Χ
Α
Ρ
Α
Κ
Τ
Η
Ρ
ΙΣ
Τ
ΙΚ
Α
Τ
Ο
Υ
Ε
Λ
Α
ΙΟ
Λ
Α
Δ
Ο
Υ
Κ
ατ
ηγ
ορ
ία
Ο
ξύ
τη
τα
(%
)
(*
)
Α
ρι
θμ
ός
υπ
ερ
οξ
ει
-
δί
ω
ν
m
E
q
O
2/
kg
(*
)
Κ
ηρ
οί
m
g/
kg
(*
*)
2-
μο
νο
πα
λμ
ιτ
ίν
η
(%
)
Σ
τι
γμ
α-
στ
αδ
ιέ
νι
ο
m
g/
kg
(1
)
Δ
ια
φ
ορ
ά
E
C
N
-
H
P
L
C
κα
ι
E
C
N

εω
ρη
τι
-
κό
ς
υπ
ο-
λο
γι
σμ
ός
)
K
(*
)
K
(*
)
D
el
ta
-
K
(*
)
Ο
ργ
αν
ολ
ηπ
τι
κή
εξ
έτ
ασ
η
Δ
ιά
με
-
σο
ς
το
υ
ελ
ατ
-
τώ
μα
το
ς
(M
d)
(*
)
Ο
ργ
αν
ολ
η-
πτ
ικ
ή
εξ
έ-
τα
ση
Δ
ιά
με
-
σο
ς
το
υ
φ
ρο
υτ
ώ
δο
υς
(M
f)
(*
)
1.
Ε
ξα
ιρ
ετ
ικ
ό
πα
ρθ
έν
ο
ελ
αι
όλ
αδ
ο

0,



0,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ

%

1,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ
>
%

0,

0,

2,

0,

0,
M
d
=
M
f
>
2.
Π
αρ
θέ
νο
ελ
αι
όλ
αδ
ο

2,



0,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ

%

1,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ
>
%

0,

0,

2,

0,

0,
M
d

2,
M
f
>
3.
Ε
λα
ιό
λα
δο
λα
μπ
άν
τε
>
2,


(3
)

0,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ

%

1,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ
>
%

0,

0,



M
d
>
2,
(2
)

4.
Ε
ξε
υγ
εν
ισ
μέ
νο
ελ
αι
όλ
αδ
ο

0,



0,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ

%

1,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ
>
%


0,


1,

0,


5.
Σ
ύν
θε
το
ελ
αι
όλ
αδ
ο
απ
οτ
ελ
ού
-
με
νο
απ
ό
εξ
ευ
γε
νι
σμ
έν
α
κα
ι
πα
ρθ
έν
α
ελ
αι
όλ
αδ
α

1,



0,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ

%

1,
εά
ν
%
ολ
ικ
ό
πα
λμ
ιτ
ικ
ό
οξ
ύ
>
%


0,


0,

0,


6.
Α
κα
τέ
ργ
ασ
το
πυ
ρη
νέ
λα
ιο


>
(4
)

1,


0,





7.
Ε
ξε
υγ
εν
ισ
μέ
νο
πυ
ρη
νέ
λα
ιο

0,

>

1,


0,


2,

0,


8.
Π
υρ
ην
έλ
αι
ο

1,

>

1,


0,


1,

0,


(1
)
Ά
θρ
οι
σμ
α
τω
ν
ισ
ομ
ερ
ώ
ν
πο
υ
θα
μπ
ορ
ού
σα
ν
να
δι
αχ
ω
ρι
στ
ού
ν

όχ
ι)
με
τρ
ιχ
οε
ιδ
ή
στ
ήλ
η.
(2
)
Ή
εά
ν
η
δι
άμ
εσ
ος
το
υ
ελ
ατ
τώ
μα
το
ς
εί
να
ι
μι
κρ
ότ
ερ
η
ή
ίσ
η
με
2,
κα
ι
η
δι
άμ
εσ
ος
το
υ
φ
ρο
υτ
ώ
δο
υς
ισ
ού
τα
ι
με
0.
(3
)
Τ
α
έλ
αι
α
με
πε
ρι
εκ
τι
κό
τη
τα
σε
κη
ρο
ύς
με
τα
ξύ
κα
ι
m
g/
kg
θε
ω
ρο
ύν
τα
ι
ελ
αι
όλ
αδ
α
λα
μπ
άν
τε
,
εά
ν
οι
ολ
ικ
ές
αλ
ει
φ
ατ
ικ
ές
αλ
κο
όλ
ες
εί
να
ι
χα
μη
λό
τε
ρε
ς
ή
ίσ
ες
με
m
g/
kg
ή
εά
ν
η
εκ
ατ
οσ
τι
αί
α
αν
αλ
ογ
ία
ερ
υθ
ρο
δι
όλ
ης
κα
ι
ου
βα
όλ
ης
εί
να
ι
μι
κρ
ότ
ερ
η
ή
ίσ
η
με
3,
5.
(4
)
Τ
α
έλ
αι
α
με
πε
ρι
εκ
τι
κό
τη
τα
σε
κη
ρο
ύς
με
τα
ξύ
κα
ι
m
g/
kg
θε
ω
ρο
ύν
τα
ι
ακ
ατ
έρ
γα
στ
α
πυ
ρη
νέ
λα
ια
,
εά
ν
οι
ολ
ικ
ές
αλ
ει
φ
ατ
ικ
ές
αλ
κο
όλ
ες
υπ
ερ
βα
ίν
ου
ν
τα
m
g/
kg
κα
ι
εά
ν
η
εκ
ατ
οσ
τι
αί
α
αν
αλ
ογ
ία
ερ
υθ
ρο
δι
όλ
ης
κα
ι
ου
βα
όλ
ης
υπ
ερ
βα
ίν
ει
το
3,
5.

M
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 11
Κ
ατ
ηγ
ορ
ία
Π
ερ
ιε
κτ
ικ
ότ
ητ
α
σε
οξ
έα
(1
)
Ά
θρ
οι
-
σμ
α
τω
ν
ισ
ομ
ε-
ρώ
ν
το
υ
tr
an
s-
ελ
αϊ
κο
ύ
οξ
έο
ς
(%
)
Ά
θρ
οι
-
σμ
α
τω
ν
ισ
ομ
ε-
ρώ
ν
το
υ
tr
an
s-
λι
νε
λα
ϊ-
κο
ύ
+
tr
an
s-
λι
νο
λε
νι
-
κο
ύ
οξ
έο
ς
(%
)
Σ
ύν
θε
ση
τω
ν
στ
ερ
ολ
ώ
ν
Ο
λι
κέ
ς
στ
ερ
όλ
ες
(m
g/
kg
)
Ε
ρυ
θρ
ο-
δι
όλ
η
κα
ι
ου
βα
όλ
η
(%
)
(*
*)
Μ
υρ
ι-
στ
ικ
ό
(%
)
Λ
ιν
ολ
ε-
νι
κό
(%
)
Α
ρα
χι
-
δι
κό
(%
)
Ε
ικ
οσ
ε-
νι
κό
(%
)
Β
εχ
εν
ικ
ό
(%
)
Λ
ιγ
νο
-
κη
ρι
κό
(%
)
Χ
ολ
η-
στ
ερ
όλ
η
(%
)
Β
ρα
σι
-
κα
στ
ε-
ρό
λη
(%
)
Κ
αμ
πε
-
στ
ερ
όλ
η
(%
)
Σ
τι
γμ
ασ
τε
-
ρό
λη
(%
)
β-
Σ
ιτ
οσ
τε
-
ρό
λη
(%
)
(2
)
δ-
7-
Σ
τι
γ-
μα
στ
εν
όλ
η
(%
)
1.
Ε
ξα
ιρ
ετ
ικ
ό
πα
ρθ
έν
ο
ελ
αι
όλ
αδ
ο

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,
<
Κ
αμ
π.

,0

0,


4,
2.
Π
αρ
θέ
νο
ελ
αι
όλ
αδ
ο

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,
<
Κ
αμ
π.

,0

0,


4,
3.
Ε
λα
ιό
λα
δο
λα
μπ
άν
τε

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,


,0

0,


4,
(3
)
4.
Ε
ξε
υγ
εν
ισ
μέ
νο
ελ
αι
ό-
λα
δο

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,
<
Κ
αμ
π.

,0

0,


4,
5.
Σ
ύν
θε
το
ελ
αι
όλ
αδ
ο
απ
ο-
τε
λο
ύμ
εν
ο
απ
ό
εξ
ευ
γε
νι
-
σμ
έν
α
κα
ι
πα
ρθ
έν
α
ελ
αι
όλ
αδ
α

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,
<
Κ
αμ
π.

,0

0,


4,
6.
Α
κα
τέ
ργ
ασ
το
πυ
ρη
νέ
λα
ιο

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,


,0

0,

>
4,
(4
)
7.
Ε
ξε
υγ
εν
ισ
μέ
νο
πυ
ρη
νέ
-
λα
ιο

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,
<
Κ
αμ
π.

,0

0,

>
4,
8.
Π
υρ
ην
έλ
αι
ο

0,

1,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

0,

4,
<
Κ
αμ
π.

,0

0,

>
4,
(1
)
Π
ερ
ιε
κτ
ικ
ότ
ητ
α
σε
άλ
λα
λι
πα
ρά
οξ
έα
(%
):
πα
λμ
ιτ
ικ
ό:
7,
5-
,0
·
πα
λμ
ιτ
ελ
αϊ
κό
:
0,
3-
3,

δε
κα
επ
τα
νι
κό
:

0,

δε
κα
επ
τε
νι
κό
:

0,

στ
εα
τι
κό
:
0,
5-
5,

ελ
αϊ
κό
:
,0
-8
3,

λι
νε
λα
ϊκ
ό:
3,
5-
,0
.
(2
)
Ά
θρ
οι
σμ
α
τω
ν:
δ-
5,

τι
γμ
ασ
τα
δι
εν
όλ
η
+
κλ
ερ
οσ
τε
ρό
λη
+
β-
σι
το
στ
ερ
όλ
η
+
σι
το
στ
αν
όλ
η
+
δ-
5-
αβ
εν
ασ
τε
ρό
λη
+
δ-
5,

τι
γμ
ασ
τα
δι
εν
όλ
η.
(3
)
Τ
α
έλ
αι
α
με
πε
ρι
εκ
τι
κό
τη
τα
σε
κη
ρο
ύς
με
τα
ξύ
κα
ι
m
g/
kg
θε
ω
ρο
ύν
τα
ι
ελ
αι
όλ
αδ
α
λα
μπ
άν
τε
,
εά
ν
οι
ολ
ικ
ές
αλ
ει
φ
ατ
ικ
ές
αλ
κο
όλ
ες
εί
να
ι
χα
μη
λό
τε
ρε
ς
ή
ίσ
ες
με
m
g/
kg
ή
εά
ν
η
εκ
ατ
οσ
τι
αί
α
αν
αλ
ογ
ία
ερ
υθ
ρο
δι
όλ
ης
κα
ι
ου
βα
όλ
ης
εί
να
ι
μι
κρ
ότ
ερ
η
ή
ίσ
η
με
3,
5.
(4
)
Τ
α
έλ
αι
α
με
πε
ρι
εκ
τι
κό
τη
τα
σε
κη
ρο
ύς
με
τα
ξύ
κα
ι
m
g/
kg
θε
ω
ρο
ύν
τα
ι
ακ
ατ
έρ
γα
στ
α
πυ
ρη
νέ
λα
ια
,
εά
ν
οι
ολ
ικ
ές
αλ
ει
φ
ατ
ικ
ές
αλ
κο
όλ
ες
υπ
ερ
βα
ίν
ου
ν
τα
m
g/
kg
κα
ι
εά
ν
η
εκ
ατ
οσ
τι
αί
α
αν
αλ
ογ
ία
ερ
υθ
ρο
δι
όλ
ης
κα
ι
ου
βα
όλ
ης
υπ
ερ
βα
ίν
ει
το
3,
5.
Σ
ημ
ει
ώ
σε
ις
:
α)
Τ
α
απ
οτ
ελ
έσ
μα
τα
τω
ν
αν
αλ
ύσ
εω
ν
πρ
έπ
ει
να
εκ
φ
ρά
ζο
ντ
αι
με
το
ν
αρ
ιθ
μό
δε
κα
δι
κώ
ν
ψ
ηφ
ίω
ν
πο
υ
πρ
οβ
λέ
πε
τα
ι
γι
α
κά
θε
χα
ρα
κτ
ηρ
ισ
τι
κό
.
Τ
ο
τε
λε
υτ
αί
ο
αρ
ιθ
μη
τι
κό
ψ
ηφ
ίο
πρ
έπ
ει
να
αυ
ξά
νε
τα
ι
κα
τά
μί
α
μο
νά
δα
,
εά
ν
το
επ
όμ
εν
ο
ψ
ηφ
ίο
εί
να
ι
με
γα
λύ
τε
ρο
απ
ό
4.
β)
Α
ρκ
εί
κα
ι
έν
α
μό
νο
χα
ρα
κτ
ηρ
ισ
τι
κό
να
μη
ν
αν
τα
πο
κρ
ίν
ετ
αι
στ
ις
αν
αγ
ρα
φ
όμ
εν
ες
τι
μέ
ς
γι
α
να
αλ
λά
ξε
ι
το
ελ
αι
όλ
αδ
ο
κα
τη
γο
ρί
α
ή
να
δη
λω
θε
ί
ότ
ι
δε
ν
εί
να
ι
σύ
μφ
ω
νο
όσ
ον
αφ
ορ
ά
τη
γν
ησ
ιό
τη
τα
.
γ)
Τ
α
χα
ρα
κτ
ηρ
ισ
τι
κά
πο
υ
ση
με
ιώ
νο
ντ
αι
με
ασ
τε
ρί
σκ
ο
(*
),
αν
αφ
ερ
όμ
εν
α
στ
ην
πο
ιό
τη
τα
το
υ
ελ
αι
ολ
άδ
ου
,
υπ
οδ
ηλ
ώ
νο
υν
ότ
ι:

πρ
οκ
ει
μέ
νο
υ
γι
α
ελ
αι
όλ
αδ
ο
λα
μπ
άν
τε
,
τα
σχ
ετ
ικ
ά
όρ
ια
μπ
ορ
ού
ν
να
μη
ν
τη
ρο
ύν
τα
ι
συ
γχ
ρό
νω
ς,

πρ
οκ
ει
μέ
νο
υ
γι
α
πα
ρθ
έν
α
ελ
αι
όλ
αδ
α,
η
μη
τή
ρη
ση
το
υλ
άχ
ισ
το
ν
εν
ός
απ
ό
τα
όρ
ια
αυ
τά
συ
νε
πά
γε
τα
ι
αλ
λα
γή
κα
τη
γο
ρί
ας
,
το
ελ
αι
όλ
αδ
ο
όμ
ω
ς
εξ
ακ
ολ
ου
θε
ί
να
κα
τα
τά
σσ
ετ
αι
σε
μί
α
απ
ό
τι
ς
κα
τη
γο
ρί
ες
πα
ρθ
έν
ου
ελ
αι
ολ
άδ
ου
.
δ)
Τ
α
χα
ρα
κτ
ηρ
ισ
τι
κά
πο
υ
ση
με
ιώ
νο
ντ
αι
με
δύ
ο
ασ
τε
ρί
σκ
ου
ς
(*
*)
,
αν
αφ
ερ
όμ
εν
α
στ
ην
πο
ιό
τη
τα
το
υ
ελ
αι
ολ
άδ
ου
,
υπ
οδ
ηλ
ώ
νο
υν
ότ
ι,
γι
α
όλ
α
τα
πυ
ρη
νέ
λα
ια
,
τα
σχ
ετ
ικ
ά
όρ
ια
μπ
ορ
ού
ν
να
μη
ν
τη
ρο
ύν
τα
ι
συ
γχ
ρό
νω
ς.

M
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ια
Δειγματοληψία ελαιολάδου ή πυρηνελαίου που παραδίδονται σε άμεσες
συσκευασίες των 100 λίτρων κατ' ανώτατο όριο
Η παρούσα μέθοδος δειγματοληψίας εφαρμόζεται για παραδόσεις ελαιολάδου ή
πυρηνελαίου κατ' ανώτατο όριο 125 000 λίτρων, που είναι συσκευασμένες σε
άμεσες συσκευασίες των 100 λίτρων, κατ' ανώτατο όριο.
Όταν η παράδοση είναι μεγαλύτερη από 125 000 λίτρα, υποδιαιρείται σε παρτί-
δες, ίσες ή μικρότερες από 125 000 λίτρα. Όταν η παράδοση είναι μικρότερη από
125 000 λίτρα αποτελεί μία παρτίδα. Η μέθοδος εφαρμόζεται στην περίπτωση
αυτή σε κάθε παρτίδα.
Σε συνάρτηση με το μέγεθος της παρτίδας, καθορίζεται ο ελάχιστος αριθμός των
βασικών δειγμάτων, σύμφωνα με τον πίνακα που εμφαίνεται στο σημείο 1.
Η σημασία του βασικού δείγματος καθορίζεται από τη χωρητικότητα των άμε-
σων συσκευασιών, σύμφωνα με τον πίνακα που προβλέπεται στο σημείο 2.1.
Θεωρείται ως παράδοση, βασικό δείγμα και εργαστηριακό δείγμα, ότι αναφέρε-
ται στους ορισμούς της προδιαγραφής EN ISO 5555.
Θεωρείται ως «παρτίδα» ένα σύνολο μονάδων πώλησης που παράγονται, παρα-
σκευάζονται και συσκευάζονται σε τέτοιες συνθήκες ώστε το έλαιο που περιέ-
χεται σε καθεμία από αυτές τις μονάδες πώλησης να θεωρείται ομοιογενές ως
προς όλα τα αναλυτικά χαρακτηριστικά.
1. ΑΡΙΘΜΟΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ
Ο ελάχιστος αριθμός των βασικών δειγμάτων καθορίζεται σε συνάρτηση με
το μέγεθος της παρτίδας σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα:
Μέγεθος της παρτίδας (σε λίτρα) κατώ-
τερο από
Ελάχιστος αριθμός βασικών δειγμάτων
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Οι άμεσες συσκευασίες του ίδιου βασικού δείγματος πρέπει να επιλέγονται
από γειτονικά σημεία της παρτίδας.
Σε περίπτωση αμφιβολίας, το κράτος μέλος αυξάνει τον αριθμό των βασι-
κών δειγμάτων που πρέπει να ληφθούν.
2. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΕΝΟΣ ΒΑΣΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ
2.1 Κάθε βασικό δείγμα αποτελείται από:
Σε περίπτωση που οι άμεσες συσκευασίες
έχουν χωρητικότητα:
Το βασικό δείγμα αφορά το έλαιο:
α) Μεγαλύτερη ή ίση από 5 λίτρα α) Τριών άμεσων συσκευασιών
β) Μεγαλύτερη ή ίση από 3 λίτρα
και μικρότερη από 5 λίτρα
β) Τριών άμεσων συσκευασιών
γ) Μεγαλύτερη ή ίση από 2 λίτρα
και μικρότερη από 3 λίτρα
γ) Τριών άμεσων συσκευασιών
δ) Μεγαλύτερη ή ίση από 1 λίτρο
και μικρότερη από 2 λίτρα
δ) Έξι άμεσων συσκευασιών
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 12
Σε περίπτωση που οι άμεσες συσκευασίες
έχουν χωρητικότητα:
Το βασικό δείγμα αφορά το έλαιο:
ε) Μεγαλύτερη ή ίση από 0,75
λίτρα και μικρότερη από 1 λίτρο
ε) Έξι άμεσων συσκευασιών
στ) Μικρότερη από 0,75 λίτρα στ) Τρεις φορές το έλαιο του ελάχι-
στου αριθμού συσκευασιών,
των οποίων η συνολική χωρητι-
κότητα υπερβαίνει τα 1,5 λίτρα
2.2 Τα βασικά δείγματα πρέπει να διατηρούνται στις άμεσες συσκευασίες
μέχρι τη στιγμή των αναλύσεων. Το έλαιο των βασικών δειγμάτων στη
συνέχεια, ενδεχομένως, υποδιαιρείται σε τρία εργαστηριακά δείγματα
για να πραγματοποιηθούν:
α) οι αναλύσεις που αναφέρονται στα παραρτήματα II, III, IX και Χ·
β) η ανάλυση που αναφέρεται στο παράρτημα XΙΙ·
γ) οι λοιπές αναλύσεις.
2.3 Οι συσκευασίες που αποτελούν ένα βασικό δείγμα υποδιαιρούνται σύμ-
φωνα με τις διαδικασίες ελέγχου που προβλέπονται από τις εθνικές
νομοθεσίες.
3. ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
α) Κάθε ένα από τα βασικά δείγματα που αναφέρεται στο σημείο 1, υπο-
διαιρείται σε εργαστηριακά δείγματα, σύμφωνα με το σημείο 2.5 της
προδιαγραφής EN ISO 5555, για να υποβληθεί στις ακόλουθες αναλύ-
σεις:
— προσδιορισμός των ελεύθερων λιπαρών οξέων, όπως αναφέρεται στο
άρθρο 2 παράγραφος 1 πρώτη περίπτωση,
— προσδιορισμός του δείκτη υπεροξειδίων, όπως αναφέρεται στο άρθρο
2 παράγραφος 1 δεύτερη περίπτωση,
— φασμαφωτομετρική ανάλυση, όπως αναφέρεται στο άρθρο 2 παρά-
γραφος 1 όγδοη περίπτωση,
— σύνθεση σε λιπαρά οξέα, όπως αναφέρεται στο άρθρο 2 παράγραφος
1 ένατη περίπτωση.
β) Στην περίπτωση που, για τουλάχιστον ένα από τα βασικά δείγματα που
ελήφθησαν στην ίδια παρτίδα, τα αποτελέσματα των αναλύσεων που
αναφέρονται στο στοιχείο α) δεν συμφωνούν με όλα στα χαρακτηριστικά
της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, το σύνολο της παρτίδας θεωρείται
ως μη σύμφωνο.
Σε περίπτωση που για καθένα από τα βασικά δείγματα που ελήφθησαν
στην ίδια παρτίδα, τα αποτελέσματα των αναλύσεων που αναφέρονται
στο στοιχείο α) δεν είναι όλα ομοιογενή, λαμβανομένων υπόψη των
χαρακτηριστικών επαναληψιμότητας των σχετικών μεθόδων, το σύνολο
της παρτίδας δηλώνεται ως μη ομοιογενές και κάθε βασικό δείγμα υπο-
βάλλεται στις άλλες απαιτούμενες αναλύσεις. Σε αντίθετη περίπτωση,
ένα μόνον από τα βασικά δείγματα της εν λόγω παρτίδας υποβάλλεται
στις απαιτούμενες αναλύσεις.
γ) Σε περίπτωση που ένα από τα αποτελέσματα των αναλύσεων που ανα-
φέρονται στο στοιχείο β) δεύτερο εδάφιο δεν ανταποκρίνεται στα χαρα-
κτηριστικά της κατηγορίας ελαίου που δηλώθηκε, το σύνολο της σχετι-
κής παρτίδας θεωρείται μη σύμφωνο.
Σε περίπτωση που όλα τα αποτελέσματα των αναλύσεων που αναφέρο-
νται στο στοιχείο β) δεύτερο εδάφιο συμφωνούν με τα χαρακτηριστικά
της κατηγορίας ελαίου που δηλώθηκε, το σύνολο της παρτίδας θεωρείται
σύμφωνο.
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 13
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ιβ
Διάγραμμα αποφάσεων για την εξακρίβωση της συμφωνίας ενός δείγματος
ελαιολάδου με τη δηλωθείσα κατηγορία
Η ανάλυση της συμφωνίας ενός ελαιολάδου ή ενός πυρηνελαίου προς τη δηλω-
θείσα κατηγορία δύναται να διεξαχθεί:
α) είτε με την πραγματοποίηση, με οποιαδήποτε σειρά, των αναλύσεων που
προβλέπονται για να εξακριβωθεί η τήρηση των χαρακτηριστικών που ανα-
φέρονται στο παράρτημα Ι·
β) είτε με την πραγματοποίηση, με τη σειρά που αναφέρεται στο διάγραμμα
αποφάσεων, των αναλύσεων που προβλέπονται σε αυτό, μέχρι να φθάσουμε
σε μια από τις αποφάσεις που αναφέρονται από το εν λόγω διάγραμμα
αποφάσεων.
Οι αναλύσεις που αφορούν τους επιμολυντές, που είναι αναγκαίες για να εξα-
κριβωθεί η συμφωνία με τους κανόνες της Ευρωπαϊκής Κοινότητας πρέπει να
διεξαχθούν ξεχωριστά.
Το διάγραμμα αποφάσεων εφαρμόζεται σε όλες τις κατηγορίες ελαιολάδου και
πυρηνελαίου. Αποτελείται από πίνακες αριθμημένους από 1 έως 11 οι οποίοι
πρέπει να συμπληρωθούν σε συνάρτηση με την κατηγορία για την οποία έχει
δηλωθεί το ελαιόλαδο, με τη σειρά που προβλέπεται στον γενικό πίνακα.
Για την ανάγνωση του γενικού πίνακα στον πίνακα 11:
— η διπλή γραμμή (=) δείχνει την πορεία που πρέπει να ακολουθηθεί σε περί-
πτωση συμφωνίας (θετική απάντηση) με τους όρους που προβλέπονται στο
προηγούμενο τετραγωνίδιο. Η διάστικτη γραμμή (…) δείχνει την αντίθετη
πορεία που πρέπει να ακολουθηθεί σε περίπτωση μη συμφωνίας,
— οι τίτλοι των τετραγωνιδίων που εμφαίνονται στους πίνακες 1 έως 11 ανα-
φέρονται στις αναλύσεις που προβλέπονται από τον παρόντα κανονισμό
σύμφωνα με τις αντιστοιχίες που αναφέρονται στο προσάρτημα 1 του παρό-
ντος παραρτήματος,
— τα γράμματα της παραπομπής που εμφαίνονται στους κύκλους της αρνητικής
απόφασης των πινάκων 1 έως 11 αντιστοιχούν στις ενδεικτικές πληροφορίες
που αναφέρονται στο προσάρτημα 2 του παρόντος παραρτήματος. Δεν συν-
επάγονται από μόνα τους την υποχρέωση να συνεχιστούν οι αναλύσεις ή τη
επιβεβαίωση των υποθέσεων που αναφέρθηκαν.
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 14
Γενικός πίνακας
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 15
Πίνακας 1
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 16
Πίνακας 2
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 17
Πίνακας 3
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 18
Πίνακας 4
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 19
Πίνακας 5
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 20
Πίνακας 6
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 21
Πίνακας 7
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 22
Πίνακας 8
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 23
Πίνακας 9
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 24
Πίνακας 10
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 25
Πίνακας 11
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 26
Προσάρτημα 1
Αντιστοιχία μεταξύ των παραρτημάτων του παρόντος κανονισμού και των αναλύσεων που
αναφέρονται στο δενδροδιάγραμμα αποφάσεων
▼M21
— Οξύτητα Παράρτημα II Προσδιορισμός των ελευθέρων λιπαρών
οξέων, εν ψυχρώ μέθοδος
▼M20
— Δείκτης υπεροξειδίων Παράρτημα III Προσδιορισμός του δείκτη υπεροξειδίου
— Φασματοφωτομετρία με υπε-
ριώδες
Παράρτημα IX Φασματοφωτομετρική ανάλυση
— Οργανοληπτική αξιολόγηση Παράρτημα XII Οργανοληπτική αξιολόγηση του παρθέ-
νου ελαιολάδου
— 3,5 στιγμασταδιένια Παράρτημα XVII Μέθοδος προσδιορισμού των στιγμαστα-
διενίων στα φυτικά έλαια
— Trans ισομερή των λιπαρών
οξέων
Παράρτημα Χα και Ανάλυση με αέρια χρωματογραφία των
μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων
Παράρτημα Χβ Παρασκεύασμα μεθυλεστέρων των λιπα-
ρών οξέων
— Σύσταση σε λιπαρά οξέα Παράρτημα Χα και Μέθοδος για την παρασκευή των μεθυ-
λεστέρων των λιπαρών οξέων
Παράρτημα Χβ Παρασκεύασμα μεθυλεστέρων των λιπα-
ρών οξέων
— ΔΕCN42 Παράρτημα XVIII Προσδιορισμός της συστάσεως των τρι-
γλυκεριδίων σε ECN42 (διαφορά μεταξύ
της πραγματικής συστάσεως και θεωρη-
τικής συστάσεως)
— Σύσταση σε στερόλες και
ολικές στερόλες
Παράρτημα V Προσδιορισμός της συστάσεως και του
περιεχομένου σε στερόλες μέσω αέριας
χρωματογραφίας με τριχοειδή στήλη
— Ερυθροδιόλη και ουβαόλη Παράρτημα VI Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε
ερυθροδιόλη και ουβαόλη
▼M21
— Κορεσμένα λιπαρά οξέα στη
θέση 2
Παράρτημα VII Προσδιορισμός της εκατοστιαίας αναλο-
γίας 2-μονοπαλμιτίνης
▼M20
— Αλειφατικές αλκοόλες Παράρτημα XIX Προσδιορισμός του περιεχομένου σε
αλειφατικές αλκοόλες με αέρια χρωμα-
τογραφία με τριχοειδή στήλη
— Κορεσμένα λιπαρά οξέα στη
θέση 2
Παράρτημα VII Προσδιορισμός των κορεσμένων λιπα-
ρών οξέων στη θέση 2 του τριγλυκερι-
δίου
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 27
Προσάρτημα 2
Πίνακας 1
α) Βλέπε παρθένο ή λαμπάντε ελαιόλαδο (κριτήρια ποιότητας πίνακας 2, ή
κριτήρια ποιότητας και καθαρότητας, πίνακας 4)
β) Βλέπε λαμπάντε ελαιόλαδο (κριτήρια ποιότητας και καθαρότητας, πίνακας 4)
Πίνακας 2
α) Βλέπε λαμπάντε ελαιόλαδο (κριτήρια ποιότητας και καθαρότητας, πίνακας 4)
β) Βλέπε εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο (κριτήρια ποιότητας, πίνακας 1)
Πίνακας 3
α) Παρουσία εξευγενισμένου ελαίου (ελιάς ή άλλα)
β) Παρουσία πυρηνελαίου
Πίνακας 4
α) Βλέπε εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και παρθένο ελαιόλαδο (κριτήρια ποιό-
τητας πίνακες 1 και 2)
β) Παρουσία εξευγενισμένου ελαίου (ελιάς ή άλλα)
γ) Παρουσία πυρηνελαίου
δ) Παρουσία εστεροποιημένων ελαίων
Πίνακας 7
α) Παρουσία πυρηνελαίου
β) Παρουσία εστεροποιημένων ελαίων
Πίνακας 8
α) Παρουσία εξευγενισμένου ελαίου (ελιάς ή άλλα)
β) (Βλέπε λαμπάντε ελαιόλαδα (κριτήρια ποιότητας και καθαρότητας, πίνακας 4)
γ) Παρουσία εστεροποιημένων ελαίων
Πίνακας 11
α) Παρουσία εστεροποιημένων ελαίων
▼M20
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 28
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II
▼M21
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ, ΕΝ ΨΥΧΡΩ
ΜΕΘΟΔΟΣ
▼B
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Ο προσδιορισμός ελεύθερων λιπαρών οξέων σε ελαιόλαδα. Η περιεκτικό-
τητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα εκφράζεται ως οξύτητα υπολογισθείσα με
συμβατικό τρόπο.
1.1. Αρχή
Διαλύεται το δείγμα σε μείγμα διαλυτών και τα περιεχόμενα ελεύθερα
λιπαρά οξέα ογκομετρούνται χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξείδιου του
καλίου σε αιθανόλη.
1.2. Αντιδραστήρια
Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθα-
ρότητας και το χρησιμοποιούμενο νερό να είναι απεσταγμένο ή ισοδύνα-
μης καθαρότητας.
1.2.1. Μείγμα διαιθυλαιθέρος αιθανόλης 95 % [με αναλογία 1:1 (V/V)].
Προσοχή: Ο διαιθυλαιθέρας είναι εξαιρετικά εύφλεκτος και μπορεί να
σχηματίσει εκρηκτικά υπεροξείδια. Πρέπει να λαμβάνεται
ειδική μέριμνα κατά τη χρήση του.
Εξουδετερώνεται ακριβώς τη στιγμή χρησιμοποίησής του με το διάλυμα
υδροξείδιου του καλίου (1.2.2), με την προσθήκη 0,3 ml διαλύματος
φαινολοφθαλεϊνης (1.2.3) ανά 100 ml μείγματος.
Σημείωση: Εάν δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί διαιθυλαιθέρας, μπο-
ρεί να χρησιμοποιηθεί μείγμα διαλυτών που περιέχει αιθανόλη
και τολουόλιο. Εάν χρειαστεί, η αιθανόλη μπορεί να αντικα-
τασταθεί από 2-προπανόλη.
1.2.2. Πρότυπο διάλυμα υδροξειδίου του καλίου σε αιθανόλη, κανονικότητας
περίπου 0,1 mol/l ή, εάν χρειαστεί, περίπου 0,5 mol/l.
Η ακριβής συγκέντρωση του αιθανολικού διαλύματος υδροξείδιου του
καλίου πρέπει να είναι γνωστή και να έχει ελεγχθεί ακριβώς πριν χρησι-
μοποιηθεί. Χρησιμοποιείται διάλυμα παρασκευασμένο τουλάχιστον πέντε
ημέρες πριν από τη χρήση και αποθηκευμένο σε σκούρα (καστανή) γυά-
λινη φιάλη με ελαστικό πώμα. Το διάλυμα πρέπει να είναι άχρωμο ή
χρώματος αμυδρώς κίτρινου.
Σημείωση: Ένα σταθερό άχρωμο διάλυμα υδροξείδιου του καλίου μπορεί
να παρασκευαστεί ως εξής: Φέρονται σε βρασμό 1 000 ml
αιθανόλης με 8 g υδροξείδιου του καλίου και 0,5 g ρινισμά-
των αργιλίου και συνεχίζεται επί μία ώρα ο βρασμός με
κάθετο ψυκτήρα. Εκτελείται αμέσως διήθηση. Διαλύεται
μέσα στο διήθημα η απαιτούμενη ποσότητα υδροξείδιου του
καλίου. Αφήνονται επί αρκετές ημέρες και το διαυγές υπερ-
κείμενο υγρό διαχωρίζεται με έκχυση από το ίζημα ανθρακι-
κού καλίου.
Το διάλυμα μπορεί επίσης να παρασκευαστεί χωρίς διήθηση
ως εξής: Σε 1 000 ml αιθανόλης προστίθενται 4 ml βουτυλι-
κού αργιλίου και το μείγμα αφήνεται επί αρκετές ημέρες. Το
υπερκείμενο υγρό εκχύεται και διαλύεται η απαιτούμενη
ποσότητα υδροξείδιου του καλίου. Το διάλυμα είναι έτοιμο
προς χρήση.
1.2.3. Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυμα 10 g/l σε αιθανόλη 95-96 (V/V) ή κυανούν
της βρωμοφαινόλης (στην περίπτωση λιπών με έντονο χρώμα), διάλυμα
20 g/l σε αιθανόλη 95-96 (V/V).
1.3. Όργανα
Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός, περιλαμβάνοντας:
1.3.1. Αναλυτικό ζυγό.
1.3.2. Κωνική φιάλη των 250 ml.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 29
1.3.3. Προχοΐδα των 10 ml, βαθμονομημένη ανά 0,05 ml.
1.4. Διαδικασία
1.4.1. Παρασκευή δείγματος προς ανάλυση
Ο προσδιορισμός πραγματοποιείπαι επί του διηθημένου δείγματος, εάν η
συνολική περιεκτικότητα σε υγρασία και ξένες προσμείξεις είναι μικρό-
τερη από 1 %, ο προσδιορισμός πραγματοποιείται επί που δείγματος όπως
έχει.
1.4.2. Ποσότης του δείγματος δοκιμής
Η ποσότης του δείγματος δοκιμής είναι ανάλογη με την αναμενόμενη
οξύτητα, σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα.
Αναμενόμενος δείκτης
οξύτητας
Μάζα δείγματος δοκιμής
Ακρίβεια ζύγισης δείγμα-
τος δοκιμής
< 1 20 0,05
1 μέχρι 4 10 0,02
4 μέχρι 15 2,5 0,01
15 μέχρι 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Το δείγμα δοκιμής ζυγίζεται στην κωνική φιάλη (4.3.2).
1.4.3. Προσδιορισμός
Το δείγμα δοκιμής (1.4.2) διαλύεται σε 50 ως 150 ml του προηγούμενα
εξουδετερωμένου μείγματος διαιθυλαιθέρος και αιθανόλης (1.2.1).
Ογκομετρείται με ταυτόχρονη ανάδευση με το διάλυμα 0,1 mol υδροξεί-
διου του καλίου (1.2.2) (βλέπε σημείωση 2) έως ότου αλλάξει χρώμα ο
δείκτης (το ρόδινο χρώμα της φαινολοφθαλεΐνης επικρατεί επί τουλάχι-
στον 10 δευτερόλεπτα).
Σημειώσεις: 1. Το τιτλοδοτημένο αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του
καλίου (1.2.2) δύναται να αντικατασταθεί από ένα υδα-
τικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου ή του νατρίου, εφό-
σον ο όγκος του εισαχθέντος ύδατος δεν επιφέρει διαχω-
ρισμό των φάσεων.
2. Εάν η απαραίτητη ποσότητα διαλύματος του υδροξειδίου
του καλίου 0,1 mol/l υπερβαίνει τα 10 ml, χρησιμοποιεί-
ται ένα διάλυμα 0,5 mol/l.
3. Εάν το διάλυμα θολώνει κατά την ογκομέτρηση, προστί-
θεται μια ικανοποιητική ποσότητα μείγματος διαλυτών
προκειμένου να επιτευχθεί ένα διαυγές διάλυμα.
1.5. Έκφραση της οξύτητας επί τοις % συγκέντρωσης ελαϊκού οξέος
Η οξύτητα, εκφρασμένη σε κατά βάρος εκατοστιαία αναλογία, ισούται με:
V � c � M
� 100
m
¼ V � c � M
10 � m
όπου:
V είναι ο όγκος σε χιλιοστόλιτρα, του τιτλοδοτημένου διαλύματος
υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιμοποιηθεί,
c είναι η ακριβής συγκέντρωση, σε moles ανά λίτρο, του τιτλοδοτη-
μένου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιμοποιη-
θεί,
M είναι το γραμμομοριακό βάρος, σε γραμμάρια ανά mole, του οξέος
που χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση του αποτελέσματος
(= 282),
m είναι το βάρος, σε γραμμάρια, του δείγματος δοκιμής.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 30
Ως αποτέλεσμα λαμβάνεται ο αριθμητικός μέσος όρος ►M6 δύο προ-
σδιορισμών ◄.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 31
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΩΝ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η προδιαγραφή αυτη περιγράφει μια μέθοδο προσδιορισμού του αριθμού
των υπεροξειδίων ελαίων και λιπών.
2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
►C1 Η μέθοδος ◄ αυτή είναι εφαρμόσιμη σε ζωικά και φυτικά έλαια και
λίπη.
3. ΟΡΙΣΜΟΣ
Ο αριθμός υπεροξειδίων εκφράζει την ποσότητα αυτών των συστατικών του
δείγματος (εκφρασμένη σε χιλιοστοϊσοδύναμα ενεργού οξυγόνου ανά kg)
που οξειδώνουν το ιωδιούχο κάλιο κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες
αναλύσεις.
4. ΑΡΧΗ
Το ληφθέν δείγμα διαλύεται σε μείγμα οξεικού οξέος και χλωροφόρμιου και
προστίθεται διάλυμα ιωδιούχου καλίου. Ογκομέτρηση του απελευθερούμε-
νου ιωδίου με πρότυπο διάλυμα θειοθειικού νατρίου.
5. ΟΡΓΑΝΑ
Όλος ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός πρέπει να είναι απαλλαγμένος ανα-
γωγικών ή οξειδωτικών ουσιών.
Σημείωση: Να μην λιπαίνονται οι εσμυρισμένες επιφάνειες.
5.1. Γυάλινο κουτάλι των 3 ml.
5.2. Εσμυρισμένες φιάλες με πώματα, χωρητικότητας περίπου 250 ml, οι οποίες
προηγουμένως έχουν ξηρανθεί και στις οποίες έχει διαβιβάσθει αδρανές
αέριο (άζωτο ή, προτιμότερα, διοξείδιο του άνθρακα).
5.3. Προχοΐδα των 25 ή 50 ml, βαθμολογημένη ανά 0,1 ml.
6. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
6.1. Χλωροφόρμιο, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγμένο οξυγόνου με διοχέ-
τευση υπό πίεση, μέσα από αυτό, ρεύματος καθαρού, ξηρού αδρανούς
αερίου.
6.2. Κρυσταλλικό οξεικό οξύ, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγμένο οξυγόνου
με διοχέτευση, υπό πίεση, μέσα από αυτό, καθαρού, ξηρού αερίου.
6.3. Κεκορεσμένο υδατικό διάλυμα ΚΙ προσφάτως παρασκευασθέν, απαλλαγ-
μένο από ιώδιο και ιωδικά.
6.4. Πρότυπο διάλυμα ►C1 θειθειικού ◄ νατρίου 0,01 ή 0,002 N, τιτλοδο-
τημένο μόλις πριν χρησιμοποιηθεί.
6.5. Υδατικό διάλυμα αμύλου 10 g/l, πρόσφατα παρασκευασμένο από φυσικό
διαλυτό άμυλο.
7. ΔΕΙΓΜΑ
Να ληφθεί μέριμνα για την παραλαβή και διατήρηση του δείγματος μακριά
από φώς, θερμότητα και σε εντελώς γεμάτα γυάλινα δοχεία, ερμητικά σφρα-
γισμένα με πώματα, από αδιαφανές γυαλί ή φελλό.
8. ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΑΛΥΣΕΩΣ
Η ανάλυση πρέπει να γίνεται με διάχυτο φυσικό ή με τεχνητό φωτισμό.
Ζυγίζεται σε γυάλινο κουτάλι (5.1) ή εάν αυτό δεν υπάρχει, σε φιάλη (5.2)
με ακρίβεια 0,001 g, ποσότης του δείγματος σύμφωνα με τον ακόλουθο
πίνακα, ανάλογα με τον αναμενόμενο αριθμό υπεροξειδίων.
Αναμενόμενος αριθμός υπεροξειδίων
(mEq)
Βάρος δείγματος σε gr
(g)
0-12 5,0-2,0
12-20 2,0-1,2
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 32
Αναμενόμενος αριθμός υπεροξειδίων
(mEq)
Βάρος δείγματος σε gr
(g)
20-30 1,2-0,8
30-50 0,8-0,5
50-90 0,5-0,3
Αποπωματίζεται μία φιάλη (5.2) και εισάγεται το γυάλινο κουτάλι που
περιέχει τη ζυγισθείσα ποσότητα του δείγματος. Προστίθενται 10 ml χλω-
ροφόρμιου (6.1). Διαλύεται το δείγμα γρήγορα με ανάδευση. Προστίθενται
15 ml οξικού οξέος (6.2), κατόπιν 1 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (6.3).
Πωματίζεται γρήγορα, γίνεται ανάδευση επί ένα λεπτό, και αφήνεται για 5
λεπτά ακριβώς, μακριά από το φώς σε θερμοκρασία 15 έως 25 °C.
Προστίθενται περίπου 75 ml απεσταγμένου νερού. Το απελευθερούμενο
ιώδιο ογκομετρείται με το διάλυμα του θειοθειικού νατρίου (6.4) (διάλυμα
0,002 N για αναμενόμενες τιμές μικρότερες από 12, και διάλυμα 0,01 N για
αναμενόμενες τιμές πάνω από 12) με ζωηρή ανάδευση, χρησιμοποιώντας
διάλυμα αμύλου (6.5) σαν δείκτη.
Εκτελούνται δύο ποσδιορισμοί στο ίδιο δοκιμαστικό δείγμα.
Εκτελείται ταυτόχρονα λευκός προσδιορισμός (τυφλός). Εάν το αποτέλεσμα
του τυφλού ξεπερνά τα 0,05 ml διαλύματος 0,01 N θειοθειικού νατρίου
(6.4), αντικαθίστανται τα αντιδραστήρια.
9. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Ο αριθμός υπεροξειδίων (AY), εκπεφρασμένος σε χιλιοστοϊσοδύναμα ενερ-
γού οξυγόνου ανά kg, δίνεται από τη σχέση:
AY ¼ V � T � 1000
m
όπου V είναι ο αριθμός των ml του προτύπου διαλύματος θειο-
θειικού νατρίου (6.4) χρησιμοποιούμενου για την ογκομέ-
τρηση, μετά την αφαίρεση του λευκού,
T είναι η ακριβής κανονικότητα του διαλύματος θειοθειικού
νατρίου (6.4) που χρησιμοποιείται,
m είναι το βάρος του δείγματος σε g.
Σαν αποτέλεσμα λαμβάνεται ο αριθμητικός μέσος των δύο εκτελεσθέντων
προσδιορισμών.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 33
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΚΗΡΟΥΣ ΜΕ ΑΕΡΙΑ
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται διαδικασία προσδιορισμού της περιε-
κτικότητας των ελαιολάδων σε κηρούς. Οι κηροί διαχωρίζονται ανάλογα
με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιη-
θεί κυρίως για τη διάκριση μεταξύ του ελαιολάδου που λαμβάνεται με
έκθλιψη και εκείνου που λαμβάνεται με εκχύλιση (πυρηνέλαιο).
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Προστίθεται στη λιπαρή ουσία κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο και ακο-
λουθεί διαχωρισμός με χρωματογραφία σε στήλη ένυδρου διοξειδίου του
πυριτίου (silica gel). Παραλαμβάνεται το πρώτο κλάσμα που εκλούεται
στις συνθήκες της δοκιμής (με πολικότητα μικρότερη εκείνης των τριγλυ-
κεριδίων) και υποβάλλεται σε άμεση ανάλυση με αέρια χρωματογραφία
τριχοειδούς στήλης.
3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ
3.1. Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml.
3.2. Γυάλινη στήλη για αέρια χρωματογραφία, εσωτερικής διαμέτρου 15,0 mm
και ύψους 30-40 cm, εφοδιασμένη με στρόφιγγα.
3.3. Αεριοχρωματογράφος δυνάμενος να λειτουργεί με τριχοειδή στήλη, εφο-
διασμένος με σύστημα απευθείας εισαγωγής του δείγματος στη στήλη και
αποτελούμενος από:
3.3.1. Θερμοστατούμενο θάλαμο στηλών, εξοπλισμένο με προγραμματιστή θερ-
μοκρασίας.
3.3.2. Σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ για απευθείας εισαγωγή στη στήλη.
3.3.3. Ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και μετατροπέα-ενισχυτή.
3.3.4. Καταγραφέα-ολοκληρωτή δυνάμενο να λειτουργεί με τον μετατροπέα-ενι-
σχυτή (3.3.3), με χρόνο απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο
και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού. (Μπορούν επίσης να χρησιμοποιη-
θούν πληροφορικά συστήματα, στα οποία τα αεριοχρωματογραφικά δεδο-
μένα λαμβάνονται με τη βοήθεια υπολογιστή.)
3.3.5. Τριχοειδή στήλη από γυαλί ή τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 8
έως 12 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επικαλυμμένη εσω-
τερικά με υγρή φάση, ομοιόμορφου πάχους 0,10 έως 0,30 μm (Κατάλ-
ληλη υγρή φάση του εμπορίου, τύπου SE 52 ή SE 54.)
3.4. Μικροσύριγγα των 10 μl για την απευθείας εισαγωγή στη στήλη, με
συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα.
3.5. Ηλεκτρικός δονητής.
3.6. Περιστροφικός εξατμιστήρας.
3.7. Ηλεκτρικός κλίβανος.
3.8. Αναλυτικός ζυγός με ακρίβεια ζύγισης ± 0,1 mg.
3.9. Συνήθη εργαστηριακά γυάλινα σκεύη.
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού 60 έως 200 μm
H silica gel πρέπει να τοποθετείται στον κλίβανο σε θερμοκρασία 500 °C
επί 4 ώρες τουλάχιστον. Αφού ψυχθεί, προστίθεται νερό σε αναλογία 2 %
της ληφθείσας ποσότητας silica gel. Το μείγμα αναδεύεται κατάλληλα,
ώστε να ομοιογενοποιηθεί και φυλάσσεται στο σκοτάδι επί 12 τουλάχι-
στον ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.
4.2. n-εξάνιο για χρωματογραφία.
4.3. Αιθυλαιθέρας για χρωματογραφία.
4.4. n-επτάνιο για χρωματογραφία.
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 34
4.5. Πρότυπο διάλυμα λαυρικού αραχιδεστέρα 0,1 % (m/V) σε εξάνιο (εσω-
τερικό πρότυπο) (Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί παλμιτικός παλμιτε-
στέρας ή μυριστικός στεατεστέρας.)
4.5.1. Χρωστική Soudan 1 (1-φαινυλ-αζω-2-ναφθόλη)
4.6. Φέρον αέριο: καθαρό υδρογόνο ή ήλιο, για αέρια χρωματογραφία
4.7. Βοηθητικά αέρια:
— καθαρό υδρογόνο για αέρια χρωματογραφία,
— καθαρός αέρας, για αέρια χρωματογραφία.
5. ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ
5.1. Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης
Σχηματίζεται εναιώρημα 15 g silica gel (4.1) σε n-εξάνιο (4.2) και εισ-
άγεται στη στήλη (3.2). Αφήνεται να κατακαθίσει. Η αυτόματη καθίζηση
συμπληρώνεται με τη βοήθεια ηλεκτρικού αναδευτήρα (3.5), ώστε η χρω-
ματογραφική στιβάδα να γίνει πιο ομοιογενής. Διηθούνται μέσω της στή-
λης 30 ml n-εξανίου για να απομακρυνθούν οι ενδεχόμενες ξένες προ-
σμείξεις. Ζυγίζονται με ακρίβεια στον αναλυτικό ζυγό (3.8) 500 mg δείγ-
ματος μέσα στη φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1) και προστίθεται η
κατάλληλη ποσότητα εσωτερικού προτύπου (4.5), ανάλογα με την εκτι-
μώμενη περιεκτικότητα σε κηρούς. Για παράδειγμα, προστίθεται 0,1 mg
λαυρικού αραχιδεστέρα στην περίπτωση του ελαιολάδου και 0,25 έως
0,50 mg στην περίπτωση του πυρηνελαίου. Το παρασκευαζόμενο με
τον τρόπο αυτό δείγμα φέρεται στη χρωματογραφική στήλη με τη βοήθεια
δύο ποσοτήτων n-εξανίου (4.2) των 2 ml.
Αφήνεται ο διαλύτης να εκρεύσει μέχρι ύψους 1 mm πάνω από το προσ-
ροφητικό και, κατόπιν, διηθούνται μέσω της στήλης 70 ml n-εξανίου
ακόμη, για να απομακρυνθούν τα φυσιολογικώς ενυπάρχοντα n-αλκάνια.
Αρχίζει τότε η χρωματογραφική έκλουση με συλλογή 180 ml μείγματος
n-εξανίου και αιθυλαιθέρα 99:1, ενώ η ταχύτητα ροής διατηρείται σε 15
σταγόνες περίπου ανά 10 δευτερόλεπτα. Το δείγμα πρέπει να εκλούεται
σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 22 ± 4 °C.
Σημειώσεις: — Το μείγμα n-εξανίου και αιθυλαιθέρα (99:1) πρέπει να
παρασκευάζεται καθημερινά.
— Για τον οπτικό έλεγχο της ορθής έκλουσης των κηρών,
είναι δυνατόν να προστεθούν στο διάλυμα του δείγματος
100 μl διαλύματος Soudan 1 % σε μείγμα έκλουσης.
Επειδή ο χρόνος κατακράτησης της χρωστικής αυτής
έχει τιμή μεταξύ εκείνης των κηρών και των τριγλυκερι-
δίων, όταν το χρώμα φθάσει στον πυθμένα της χρωματο-
γραφικής στήλης, η έκλουση πρέπει να διακοπεί, καθώς
έχουν διέλθει όλοι οι κηροί.
Το λαμβανόμενο με τον τρόπο αυτό κλάσμα ξηραίνεται στον περιστρο-
φικό εξατμιστήρα (3.6) μέχρι να απομακρυνθεί σχεδόν τελείως ο διαλύ-
της. Τα τελευταία 2 ml διαλύτη απομακρύνονται με τη διαβίβαση ελα-
φρού ρεύματος αζώτου και, στη συνέχεια, προστίθενται 2-4 ml n-επτα-
νίου.
5.2. Ανάλυση με αέρια χρωματογραφία
5.2.1. Προκαταρκτικές εργασίες
Τοποθετείται η στήλη μέσα στον αεριοχρωματογράφο (3.3) με σύνδεση
του άκρου εισόδου με το σύστημα απευθείας εισαγωγής (on-column) και
του άκρου εξόδου με τον ανιχνευτή. Εκτελούνται οι γενικοί έλεγχοι της
συσκευής αέριας χρωματογραφίας (συμπεριφορά των κυκλωμάτων των
αερίων, απόδοση του ανιχνευτή και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.).
Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται η ρύθμιση των
συνθηκών της. Διαβιβάζεται ελαφρό ρεύμα αερίου μέσω της στήλης και,
στη συνέχεια, τίθεται σε λειτουργία η συσκευή αέριας χρωματογραφίας.
Θερμαίνεται σταδιακά μέχρι να επιτευχθεί θερμοκρασία 350 °C εντός 4
ωρών περίπου. Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται επί 2 τουλάχιστον ώρες
και, κατόπιν, ρυθμίζεται η συσκευή στις συνθήκες λειτουργίας (ρύθμιση
της παροχής των αερίων, αφή της φλόγας, σύνδεση με τον ηλεκτρονικό
καταγραφέα (3.3.4), ρύθμιση της θερμοκρασίας του θαλάμου στηλών και
του ανιχνευτή κ.λπ.) και καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχι-
στον διπλάσια της προβλεπόμενης για την εκτέλεση της ανάλυσης. Η
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 35
βασική γραμμή (baseline) πρέπει να είναι ευθεία, χωρίς κορυφές και
απόκλιση.
Ευθύγραμμη αρνητική απόκλιση υποδηλώνει ατελείς συνδέσεις της στή-
λης, ενώ θετική απόκλιση υποδηλώνει ανεπαρκή ρύθμιση των συνθηκών
της στήλης.
5.2.2. Επιλογή των συνθηκών εργασίας
Κατά κανόνα, πρέπει να τηρούνται οι ακόλουθες συνθήκες εργασίας:
— θερμοκρασία της στήλης:
20 °C/
λεπτό
5 °C/
λεπτό
20 °C/
λεπτό
Κατά την
έναρξη
80 °C
(1′)
→ 240 °C → 325 °C
(6′)
→ 340 °C
(10′)
— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 350 °C,
— εγχεόμενη ποσότητα υλικού: 1 μl του n-επτανικού διαλύματος (2-4
ml),
— φέρον αέριο: ήλιο ή υδρογόνο με τη βέλτιστη γραμμική ταχύτητα για
το επιλεγμένο αέριο (βλέπε προσάρτημα),
— ευαισθησία των οργάνων: κατάλληλη ώστε να πληρούνται οι κατω-
τέρω όροι.
Οι συνθήκες αυτές μπορούν να τροποποιούνται ανάλογα με τα χαρακτη-
ριστικά της στήλης και του αεριοχρωματογράφου, ώστε να επιτυγχάνονται
διαχωρισμός όλων των κηρών, ικανοποιητική διαχωριστική (διακριτική)
ικανότητα για όλες τις κορυφές (βλέπε σχήμα) και χρόνος κατακράτησης
18 ± 3 λεπτών για το εσωτερικό πρότυπο με 32 άτομα άνθρακα (C32). Η
αντιπροσωπευτικότερη κορυφή των κηρών πρέπει να ισούται τουλάχιστον
με το 60 % της κατώτερης τιμής της κλίμακας.
Οι παράμετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει να καθορίζονται κατά
τρόπο ώστε να υπολογίζονται σωστά τα εμβαδά των κορυφών που λαμ-
βάνονται υπόψη.
Σημείωση: Λόγω της υψηλής τελικής θερμοκρασίας, γίνεται δεκτή θετική
μετατόπιση, η οποία δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10 % της
κατώτερης τιμής της κλίμακας.
5.3. Εκτέλεση της ανάλυσης
Λαμβάνεται 1 μl διαλύματος με τη μικροσύριγγα των 10 μl και αποσύ-
ρεται το έμβολο της σύριγγας, ώστε να αδειάσει η βελόνα. Εισάγεται η
βελόνα στο σύστημα έγχυσης και μετά από 1 έως 2 δευτερόλεπτα εγχέε-
ται το διάλυμα γρήγορα. Μετά από 5 δευτερόλεπτα περίπου, η βελόνα
εξάγεται αργά.
Καταγράφονται οι ενδείξεις του οργάνου μέχρι την πλήρη έκλουση των
κηρών.
Η βασική γραμμή πρέπει πάντοτε να ανταποκρίνεται στους απαιτούμενους
όρους.
5.4. Ταυτοποίηση των κορυφών
Οι διάφορες κορυφές πρέπει να ταυτοποιούνται βάσει των χρόνων κατα-
κράτησης και με σύγκριση με μείγματα κηρών γνωστών χρόνων κατα-
κράτησης, που αναλύθηκαν στις ίδιες συνθήκες.
Το κατωτέρω σχήμα απεικονίζει χρωματογράφημα των κηρών παρθένου
ελαιολάδου.
5.5. Ποσοτικός προσδιορισμός
Με τη βοήθεια του ολοκληρωτή υπολογίζονται τα εμβαδά των κορυφών
που αντιστοιχούν στο εσωτερικό πρότυπο και στους αλειφατικούς εστέρες
με 40 έως 46 άτομα άνθρακα (C40 έως C46).
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 36
Υπολογίζεται η περιεκτικότητα κάθε εστέρα σε κηρούς, σε mg/kg λιπαρής
ουσίας, σύμφωνα με τον τύπο:
εστέρας; mg=kg ¼ Ax � ms � 1000
As � m
όπου:
Ax = το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί σε κάθε εστέρα, σε
τετραγωνικά χιλιοστόμετρα,
As = το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο,
σε τετραγωνικά χιλιοστόμετρα,
ms = η προστιθέμενη μάζα εσωτερικού προτύπου, σε χιλιοστόγραμμα,
m = η μάζα του λαμβανόμενου για τον προσδιορισμό δείγματος, σε
γραμμάρια.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Αναφέρεται το άθροισμα των τιμών περιεκτικότητας σε κηρούς C40 έως
C46, σε mg/kg λιπαρής ουσίας (ppm).
Σημείωση: Τα συστατικά που πρέπει να προσδιορίζονται ποσοτικά ανα-
φέρονται στις κορυφές που αντιστοιχούν σε εστέρες με άρτιο
αριθμό ατόμων άνθρακα μεταξύ C40 και C46, κατά το παρά-
δειγμα του χρωματογραφήματος κηρών ελαιολάδου που
εμφαίνεται στο κατωτέρω σχήμα. Σε περίπτωση διπλής εμφά-
νισης του εστέρα C46, συνιστάται η ταυτοποίησή του με ανά-
λυση του κλάσματος των κηρών πυρηνελαίου, όπου η κορυφή
C46 αναγνωρίζεται εύκολα, καθώς υπερισχύει σαφώς.
Τα αποτελέσματα εκφράζονται με ένα δεκαδικό ψηφίο.
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 37
Σχήμα
Χρωματογράφημα κηρών παρθένου ελαιολάδου (1)
Υπόμνημα:
I.S. = λαυρικός αραχιδεστέρας
1 = Διτερπενικοί εστέρες
2 + 2′ = Εστέρες C40
3 + 3′ = Εστέρες C42
4 + 4′ = Εστέρες C44
5 = Εστέρες C46
6 = Τριτερπενικοί εστέρες στερολών και αλκοόλης.
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 38
(1) Μετά την έκλουση των εστέρων των στερολών, το χρωματογράφημα δεν πρέπει να παρουσιάζει σημαντικές
κορυφές (τριγλυκερίδια).
Προσάρτημα
Προσδιορισμός της γραμμικής ταχύτητας του αερίου
Εγχέονται 1 έως 3 μl μεθανίου (ή προπανίου) στον αεριοχρωματογράφο, ο
οποίος έχει προηγουμένως ρυθμιστεί στις κανονικές συνθήκες λειτουργίας. Χρο-
νομετρείται η διαδρομή του αερίου μέσω της στήλης από την έγχυσή του μέχρι
την εμφάνιση της κορυφής (tM).
Η γραμμική ταχύτητα, σε cm/s, παρέχεται από τον τύπο L/tM, όπου L το μήκος
της στήλης, σε εκατοστόμετρα, και tM ο χρόνος, σε δευτερόλεπτα.
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 39
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ V
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΤΩΝ
ΣΤΕΡΟΛΩΝ ΔΙ' ΑΕΡΙΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΜΕ ΤΡΙΧΟΕΙΔΗ
ΣΤΗΛΗ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η μέθοδος περιγράφει τη διαδικασία προσδιορισμού των περιεχομένων
στερολών, σε μια λιπαρή ουσία, μεμονωμένων και ολικών.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Η λιπαρή ουσία στην οποία έχει προστεθεί α-χολεστανόλη ως εσωτερικό
πρότυπο, σαπωνοποιείται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του
καλίου· έπειτα τα ασαπωνοποίητα συστατικά εκχυλίζονται με αιθυλικό
αιθέρα. Το στερολικό κλάσμα διαχωρίζεται από τα ασαπωνοποίητα
συστατικά δια χρωματογραφίας επί βασικής πλάκας silica gel· οι στερό-
λες που λαμβάνονται στο silica gel μετατρέπονται σε τριμεθυλοσιλιλαι-
θέρες και αναλύονται με αέριο χρωματογραφία με τριχοειδείς στήλες.
3. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
3.1. Σφαιρική φιάλη των 250 ml εφοδιασμένη με κάθετο ψυκτήρα με εσμυ-
ρισμένα άκρα.
3.2. Διαχωριστική χοάνη των 100 ml.
3.3. Σφαιρικές φιάλες των 250 ml.
3.4. Πλήρης εξοπλισμός για χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος με γυάλινες
πλάκες των 20 × 20 cm.
3.5. Λυχνία υπεριώδους φωτός, μήκους κύματος 366 ή 254 nm.
3.6. Μικροσύριγγες των 100 και 500 ml.
3.7. Διηθητική κυλινδρική χοάνη με πορώδες φίλτρο G 3 (πορώδους 15 έως
40 μm) διαμέτρου 2 cm περίπου και ύψους 5 cm με άκρο κατάλληλο για
διήθηση σε κενό αέρος και εσμυρισμένο άκρο αρσενικό 12/21.
3.8. Φιάλη εν κενώ των 50 ml με εσμυρισμένο άκρο θηλυκό 12/21 προσαρ-
μόσιμο στη διηθητική χοάνη (3.7).
3.9. Σωλήνας με κωνική βάση, των 10 ml, με πώμα ασφαλείας.
3.10. Αέριος χρωματογράφος κατάλληλος για λειτουργία με τριχοειδή στήλη
εφοδιασμένος με σύστημα διαχωρισμού, αποτελούμενο από:
3.10.1. Θερμοστατούμενο θάλαμο, για τη στήλη, ο οποίος επιτρέπει τη διατή-
ρηση της επιθυμητής θερμοκρασίας με ακρίβεια ± 1 °C.
3.10.2. Σύστημα εξάτμισης με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία και με σιλανισμένο
γυάλινο χώρο.
3.10.3. Ανιχνευτή ►C1 ιονιζούσης φλογός ◄ και μεταλλάκτη -ενισχυτή.
3.10.4. Καταγραφέα-ολοκληρωτή κατάλληλο για λειτουργία με μεταλλάκτη-ενι-
σχυτή.
3.11. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή τετηγμένο οξείδιο του πυριτίου, μήκους
20 έως 30 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, καλυμμένη
εσωτερικώς με υγρό SE-52 ή SE-54 ή άλλο ανάλογο, ομοιόμορφου
πάχους μεταξύ 0,10 και 0,30 μm.
3.12. Μικροσύριγγες για χρωματογραφία αέριας φάσης των 10 μl με σκληρυ-
μένη βελόνα.
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου περίπου 2N: διαλύονται,
ψύχοντας ταυτόχρονα, 130 g υδροξείδιου του καλίου (κατώτατου τίτλου
85 %) μέσα σε 200 ml απεσταγμένου ύδατος, έπειτα συμπληρώνονται με
αιθανόλη μέχρι το ένα λίτρο. Το διάλυμα διατηρείται ►C1 μέσα σε
σκοτεινά και καλά κλεισμένα μπουκάλια ◄.
4.2. Αιθυλικός αιθέρας αναλυτικής καθαρότητας.
4.3. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 40
4.4. Γυάλινες πλάκες καλυμμένες με silica gel χωρίς δείκτη φθορισμού,
πάχους 0,25 mm (διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες ήδη για χρήση).
4.5. Αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 0,2 N: διαλύονται 13 g
υδροξείδιου του κάλιου μέσα σε 20 ml απεσταγμένου ύδατος, έπειτα
συμπληρώνονται μέχρι το ένα λίτρο με μεθανόλη.
4.6. Βενζόλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.7. Ακετόνη, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.8. Εξάνιο, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.9. Αιθυλικός αιθέρας, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.10. Χλωροφόρμιο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.11. Διάλυμα αναφοράς για χρωματογραφία επί πλακός: χοληστερόλη ή
φυτοστερόλη, διάλυμα ►M6 2 % ◄ σε χλωροφόρμιο.
4.12. Αιθανολικό διάλυμα 2′-7′διχλωροφλονορεσκεΐνης 0,2 %. Έχει γίνει ελα-
φρά αλκαλικό με την προσθήκη μερικών σταγόνων αλκοολικού διαλύ-
ματος υδροξειδίου του καλίου, 2 N.
4.13. Άνυδρη πυριδίνη, χρωματογραφικής καθαρότητας.
4.14. Εξαμεθυλοδισιλαζάνιο (Hexamethyldisalazane).
4.15. Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο.
4.16. Διάλυμα αναφοράς των τριμεθυλοσιλιλαιθέρων των στερολών: παρα-
σκευάζεται τη στιγμή της χρήσης από τις στερόλες που λαμβάνονται
από τα έλαια που τις περιείχαν.
4.17. α-χολεστανόλη, διάλυμα 0,2 % (m/V) σε χλωροφόρμιο (εσωτερικό πρό-
τυπο).
4.18. Φέρον αέριον: υδρογόνο ή ήλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.
4.19. Βοηθητικά αέρια: υδρογόνο ή ήλιον, χρωματογραφικής καθαρότητας.
5. ΜΕΘΟΔΟΣ
5.1. Παρασκευή των ασαπωνοποίητων συστατικών.
5.1.1. Εισάγεται στη σφαιρική φιάλη των 250 ml, δια μικροσύριγγας των
500 μl, όγκος διαλύματος α-χολεστανόλης 0,2 % σε χλωροφόρμιο
(4.17) που περιέχει ποσότητα ►C1 α-χολεστανόλης ◄ που αντιστοιχεί
σε 10 % περίπου των στερολών που περιέχονται στο δείγμα που κρα-
τήθηκε για τον προσδιορισμό. Για παράδειγμα, για 5 g δείγματος, πρέπει
να προστεθούν 500 μl διαλύματος α-χολεστανόλης 0,2 %, εάν πρόκειται
για δείγμα ελαιολάδου, και 1 500 μl, εάν πρόκειται για
►M6 __________ ◄πυρηνέλαιο.
Εξατμίζεται τα χλωροφόρμιο σε ρεύμα αζώτου μέχρι να αποξηρανθεί,
έπειτα ζυγίζονται ακριβώς 5 g ξηρού διηθημένου δείγματος στην ίδια
σφαιρική φιάλη.
Στην περίπτωση των ελαίων ►M6 __________ ◄τα οποία περιέ-
χουν σημαντικές ποσότητες χοληστερόλης, μπορεί να εμφανιστεί κορυφή
η οποία έχει τον ίδιο χρόνο κατακράτησης με αυτόν της χολεστανόλης.
Σε αυτές τις περιπτώσεις, πρέπει να αναλύεται το στερολικό κλάσμα εις
διπλούν, με και χωρίς εσωτερικό πρότυπο ►M6 ή να χρησιμοποιείται
βετουλινόλη αντί χοληστανόλης ◄.
5.1.2. Προστίθενται 50 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξείδιου του καλίου
2 N, τίθεται σε λειτουργία ο κάθετος ψυκτήρας, θερμαίνεται σε υδατό-
λουτρο μέχρι ήπιο βρασμό, ανακινώντας ταυτόχρονα δυνατά μέχρι να
πραγματοποιηθεί η σαπωνοποίηση (το διάλυμα γίνεται διαυγές). Συνεχί-
ζεται η θέρμανση για 20 λεπτά, έπειτα προστίθενται 50 ml απεσταγμένου
ύδατος τα οποία ρίχνονται από το επάνω μέρος του ψυκτήρα, αποσυν-
δέεται ο ψυκτήρας και ψύχεται η σφαιρική φιάλη στους 30 °C.
5.1.3. Μεταγγίζεται ποσοτικώς το περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης σε δια-
χωριστική χοάνη των 500 ml, με τη βοήθεια απεσταγμένου ύδατος,
πολλές φορές, χρησιμοποιώντας συνολικά περίπου 50 ml. Προστίθενται
περίπου 80 ml αιθυλικού αιθέρα, ανακινώντας δυνατά για περίπου 30
δευτερόλεπτα, και αφήνεται να πραγματοποιηθεί ο διαχωρισμός
(Σημείωση 1).
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 41
Διαχωρίζεται η κάτω υδατική φάση συλλέγοντάς τη μέσα σε μια άλλη
φιάλη μετάγγισης. Πραγματοποιούνται ακόμη δύο εκχυλίσεις της υδατι-
κής φάσης, σύμφωνα με τις ίδιες οδηγίες, χρησιμοποιώντας κάθε φορά
60-70 ml αιθυλικού αιθέρα.
Σημείωση 1: Τα πιθανά γαλακτώματα μπορούν να καταστραφούν προ-
σθέτοντας μικρές ποσότητες αιθυλικής ή μεθυλικής αλκοό-
λης δια ψεκασμού.
5.1.4. Συγκεντρώνονται τα αιθερικά εκχυλίσματα σε μια μόνο διαχωριστική
χοάνη και πλένονται με απεσταγμένο ύδωρ (50 ml κάθε φορά) μέχρι
ουδέτερης αντίδρασης του ύδατος έκπλυσης.
Αφού απομακρυνθεί το ύδωρ έκπλυσης, ξηραίνονται με άνυδρο θειικό
νάτριο και διηθούνται, πάνω σε άνυδρο θειικό νάτριο, σε προζυγισμένη
σφαιρική φιάλη των 250 ml, πλένοντας φιάλη και φίλτρο με μικρές
ποσότητες αιθυλικού αιθέρα.
5.1.5. Αποστάζεται ο αιθέρας μέχρις ότου να απομείνει μικρή ποσότητα, έπειτα
αποξηραίνεται σε ελαφρό κενό ή σε ρεύμα αζώτου, ολοκληρώνεται η
ξήρανση στον κλίβανο στους 100 °C για ένα τέταρτο της ώρας περίπου
και ζυγίζεται μετά από ψύξη σε ξηραντήρα.
5.2. Διαχωρισμός του στερολικού κλάσματος.
5.2.1. Προετοιμασία των βασικών πλακών: βυθίζονται οι πλάκες από silica gel
(4.4), τελείως, μέσα σε μεθανολικό διάλυμα 0,2 N υδροξείδιου του
κάλιου (4.5) για 10 δευτερόλεπτα, αφήνονται στη συνέχεια κλεισμένες
σε σκοτεινό θάλαμο για δύο ώρες και τοποθετούνται τελικά στον κλί-
βανο σε 100 °C για μία ώρα.
Βγαίνουν από τον κλίβανο και διατηρούνται μέσα σε ένα ξηραντήρα με
χλωριούχο ασβέστιο μέχρι τη στιγμή της χρήσης (οι κατ' αυτόν τον
τρόπο επεξεργασμένες πλάκες πρέπει να χρησιμοποιούνται μέσα σε
δεκαπέντε μέρες).
Σημείωση 2: Η χρήση των βασικών πλακών silica gel για το διαχωρισμό
του στερολικού κλάσματος καταργεί την ανάγκη επεξεργα-
σίας των ασαπωνοποίητων συστατικών με την αλουμίνα.
Με αυτόν τον τρόπο, όλα τα όξινα συστατικά (λιπαρά οξέα
και άλλα) συγκρατούνται στη γραμμή εναπόθεσης. Επιτυγ-
χάνεται έτσι η ζώνη των στερολών καθαρά διαχωρισμένη
από την ταινία των αλειφατικών και τερπενικών αλκοολών.
5.2.2. Εισάγεται στο θάλαμο ανάπτυξης ένα μείγμα βενζόλιου-ακετόνης 95/5
(V/V) μέχρι ένα ύψος περίπου 1 cm. Είναι δυνατόν στη θέση του να
χρησιμοποιηθεί ένα μείγμα εξάνιου-αιθυλικού αιθέρα 65/35 (V/V). Ο
θάλαμος κλείνεται με τη βοήθεια ενός κατάλληλου σκεπάσματος και
αφήνεται έτσι για μισή ώρα τουλάχιστον, έτσι ώστε να αποκατασταθεί
ισορροπία μεταξύ υγρού και ατμού. Είναι δυνατόν, να τοποθετηθούν στις
εσωτερικές επιφάνειες του θαλάμου λωρίδες από διηθητικό χαρτί βυθι-
σμένες στο υγρό ανάπτυξης: με αυτό τον τρόπο θα μειωθεί στο ένα τρίτο
περίπου ο χρόνος μετακίνησης του μετώπου του υγρού και θα επιτευχθεί
περισσότερο ομοιόμορφη έκλουση.
Σημείωση 3: Για να υπάρξουν αναπαραγώγιμες συνθήκες έκλουσης, το
μείγμα πρέπει να αλλάζει κάθε φορά.
5.2.3. Παρασκευάζεται ένα διάλυμα 5 % περίπου ασαπωνοποίητων συστατικών
(5.1.5) μέσα σε χλωροφόρμιο και με τη μικροσύριγγα των 100 μl τοπο-
θετείται στη χρωματογραφική πλάκα (5.2.1), στα 2 cm περίπου από το
ένα άκρο, 0,3 ml του ανωτέρω διαλύματος σε μια συνεχή γραμμή, όσο
το δυνατόν πιο λεπτή και ομοιόμορφη. Στην ευθεία της γραμμής εναπό-
δεσης, τοποθετείται στο ένα άκρο της πλάκας 2-3 μl του διαλύματος
αναφοράς των στερολών (4.11), με σκοπό να προσδιορισθεί η λωρίδα
των στερολών μετά το πέρας της ανάπτυξης.
5.2.4. Τοποθετείται η πλάκα μέσα στο θάλαμο ανάπτυξης, προετοιμασμένη
όπως περιγράφεται στην 5.2.2. Η θερμοκρασία περιβάλλοντος πρέπει
να διατηρείται ανάμεσα στους 15 και 20 °C. Κλείνεται αμέσως ο θάλα-
μος με το σκέπασμα και αφήνεται μέχρις ότου το μέτωπο του διαλυτή να
ανέλθει σε ύψος 1 cm κάτω από το άνω άκρο της πλάκας. Βγαίνει στη
συνέχεια η πλάκα από το θάλαμο ανάπτυξης και ο διαλύτης εξατμίζεται
μέσα σε ρεύμα ζεστού αέρα ή ακόμη αφήνοντας την πλάκα σε σκοτεινό
θάλαμο για λίγο.
5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και με ομοιόμορφο τρόπο με το διάλυμα της
2′7′διχλωροφλουοροσκεΐνης. Τοποθετείται η λωρίδα των στερολών δια
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 42
ευθυγράμμισης με την κηλίδα που επιτεύχθηκε με το διάλυμα αναφοράς·
η λωρίδα οριοθετείται με ένα μαύρο μολύβι κατά μήκος των άκρων
φθορισμού.
5.2.6. Το silica gel που περιέχεται στην οριοθετημέη ζώνη ξύνεται με μια
μεταλική σπάτουλα. Το υλικό που αφαιρείται, λεπτά κονιοποιημένο,
εισάγεται σε μια διηθητική χοάνη (3.7). Προστίθενται 10 ml θερμού
χλωροφόρμιου, αναμιγνύονται προσεκτικά με τη μεταλλική σπάτουλα
και διηθούνται εν κενώ· έπειτα συλλέγεται το διήθημα στη φιάλη (3.8)
που συνδέεται με τη διηθητική χοάνη.
Πλένεται το υπόλειμμα στη χοάνη τρεις φορές με αιθυλικό αιθέρα (περί-
που 10 ml κάθε φορά και συλλέγεται όμοια το διήθημα μεσα στη φιάλη
την προσαρμοσμένη στη διηθητική χοάνη Εξατμίζεται το διήθημα μέχρι
να φτάσει σ' έναν όγκο περίπου 4-5 ml, μεταγγίζεται το απομένον διά-
λυμα μέσα στον προζυγισμένο σωλήνα των 10 ml (3.9), ξεραίνεται
θερμαίνοντας ελαφρά σε ελαφρύ ρεύμα αζώτου, προστίθενται μερικές
σταγόνες ακετόνης, ξεραίνεται εκ νέου, τοποθετείται 10 λεπτά περίπου
στον κλίβανο στους 105 °C, έπειτα αφήνεται να κρυώσει σε ξηραντήρα
και ζυγίζεται.
Το περιεχόμενο υπόλειμμα μέσα στο σωλήνα αποτελείται από το στε-
ρολικό κλάσμα.
5.3. Παρασκευή των τριμεθυλοσιλιλαιθέρων.
5.3.1. Στο σωλήνα που περιέχει το στερολικό κλάσμα προστίθεται το αντιδρα-
στήριο σιλανοποίησης αποτελούμενο από μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλο-
δισιλαζάνιου-τριμεθυλοχλωρισιλάνιον 9/3/1 (V/V/V) (Σημείωση 4) σε
αναλογία 50 μl ανά χιλιστό του γραμμαρίου των στερολών, αποφεύγο-
ντας κάθε απορρόφηση υγρασίας (Σημείωση 5).
Σημείωση 4: Υπάρχουν στο εμπόριο διαλύματα έτοιμα προς χρήση· επι-
πλέον, άλλα αντιδραστήρια σιλιλαιθεροποίησης όπως, για
παράδειγμα, το δις-τριμεθυλοσιλιλακεταμίδιο + 1 % τριμε-
θυλοχλωρισιλάνιο διαλυμένο με τον ίδιο όγκο ανύδρης
πυριδίνης.
5.3.2. Κλείνεται ο σωλήνας, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς να αναστρέφεται)
μέχρι την πλήρη διάλυση των στερολών. Αφήνεται να ηρεμήσει για
τουλάχιστον 15 λεπτά στη θερμοκρασία περιβάλλοντος, έπειτα φυγοκεν-
τρείται για μερικά λεπτά: το διαυγές διάλυμα είναι έτοιμο για την ανά-
λυση δια χρωματογραφίας αέριας φάσης.
Σημείωση 5: Ο σχηματισμός ελαφρού θολώματος είναι φυσιολογικός
και δεν δημιουργεί καμία επιπλοκή. Ο σχηματισμός άσπ-
ρων νιφάδων ή η εμφάνιση ροζ χρώματος οφείλονται στην
παρουσία υγρασίας ή στη φθορά του αντιδραστηρίου. Σ'
αυτή την περίπτωση, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί.
5.4. Ανάλυση δια χρωματογραφίας αέριας φάσης.
5.4.1. Προπαρασκευαστικές ενέργειες, ρύθμιση των συνθηκών λειτουργίας της
στήλης.
5.4.1.1. Η στήλη εγκαθίσταται μέσα στο χρωματογράφο αέριας φάσης, συνδέο-
ντας το άκρο της εισόδου με τον εξαερωτή τον ενωμένο με το σύστημα
κλασματοποίησης και το άκρο της εξόδου με τον ανιχνευτή.
Ελέγχεται γενικά η μονάδα του αερίου χρωματογράφου (διαρροές στα
κυκλώματα των αερίων, διαχωριστική ικανοτήτα του ανιχνευτή αποτελε-
σματικότητα του συστήματος κλασματοποίησης και του συστήματος
καταγραφής κ.λπ.).
5.4.1.2. Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να κοντισιο-
ναρισθεί. Περνάται ένα ελαφρό ρεύμα αερίου δια μέσου αυτής της στή-
λης, έπειτα ανάβεται το σύνολο της χρωματογραφίας αέριας φάσης και
ξεκινά η βαθμιαία θέρμανση μέχρι να φτάσει σε θερμοκρασία το λιγό-
τερο 20 °C μεγαλύτερη απ' αυτή της λειτουργίας (Σημείωση 6). Διατη-
ρείται αυτή η θερμοκρασία για τουλάχιστον δύο ώρες, έπειτα η μονάδα
τίθεται σε συνθήκες λειτουργίας (ρύθμιση ροής αερίων και της κλασμα-
τοποίησης, άναμμα της φλόγας, σύνδεση με τον ηλεκτρονικό καταγρα-
φέα, ρύθμιση της θερμοκρασίας του θαλάμου για τη στήλη, του ανι-
χνευτή και του συστήματος έγχυσης κ.λπ.) και καταγράφεται το σήμα
σε μια ευαισθησία τουλάχιστον δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή που
προβλέπεται για την εκτέλεση της ανάλυσης. Η γραμμή βάσεως που
επιτεύχθηκε πρέπει να είναι ευθύγραμμη, χωρίς κορυφές οιασδήποτε
μορφής και παρεκκλίσεις.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 43
Η αρνητική ευθύγραμμη παρέκκλιση δηλώνει διαρροή της στήλης, μια
θετική παρέκκλιση δηλώνει ανεπαρκή ρύθμιση της στήλης (κοντισιονά-
ρισμα).
Σημείωση 6: Η θερμοκρασία κοντισιοναρίσματος, της στήλης πρέπει να
είναι πάντα μικρότερη, τουλάχιστον 20 °C, από τη μέγιστη
προβλεπόμενη θερμοκρασία για τη χρησιμοποιούμενη στα-
τική φάση της στήλης.
5.4.2. Επιλογή των συνθηκών εργασίας
5.4.2.1. Οι προτεινόμενες συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:
— θερμοκρασία της στήλης: 260 °C ± 5 °C,
— θερμοκρασία του συστήματος εξαερωσης: 280 °C,
— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 290 °C,
— γραμμική ταχύτητα του φέροντος αερίου: ήλιο, 20 έως 35 cm/s,
υδρογόνο, 30 έως 50 cm/s,
— σχέση διαχωρισμού: από 1/50 έως 1/100,
— ευαισθησία του οργάνου: 4 έως 16 φορές της ελάχιστης ευαισθησίας,
— ευαισθησία καταγραφής: 1-2 mV f. s.,
— ταχύτητα του χαρτιού: 30-60 cm/ώρα,
— ποσότητα εγχεόμενης ουσίας: 0,5-1 μl του διαλύματος των TMSE.
Αυτές οι συνθήκες μπορούν να μεταβάλλονται σύμφωνα με τα χαρακτη-
ριστικά της στήλης και του χρωματογράφου αέριας φάσης, έτσι ώστε να
επιτυγχάνονται χρωματογραφήματα τα οποία να ικανοποιούν τις ακόλου-
θες συνθήκες:
— ο χρόνος κατακράτησης της β-σιτοστερόλης πρέπει να είναι 20 ± 5
λεπτά,
— η κορυφή της καμπεστερόλης πρέπει να είναι: για το ελαιόλαδο
(μέσο περιεχόμενο 3 %) 15 ± 5 % της πλήρους κλιμακος, για το
σογιέλαιο (μέσο περιεχόμενο 20 %) 80 ± 10 % της πλήρους κλίμα-
κας,
— πρέπει να γίνεται διαχωρισμός όλων των υπαρχουσών στερολών.
Επιπροσθέτως, για να διαχωρισθούν οι κορυφές πρέπει να έχουν
ξεχωρίσει τελείως, πράγμα το οποίο σημαίνει ότι η καμπύλη κάθε
κορυφής πρέπει να επιστρέψει στη γραμμή βάσεως πριν ξεκινήσει
για την καμπύλη της επόμενης κορυφής. Ένας ατελής διαχωρισμός
είναι, παρ' όλα αυτά, ανεκτός, υπό την προϋπόθεση, όμως, ότι θα
είναι μετρήσιμος ποσοτικά η κορυφή TRR 1,02 χρησιμοποιώντας την
κάθετο.
5.4.3. Εκτέλεση της ανάλυσης
5.4.3.1. Λαμβάνεται, με μια μικροσύριγγα των 10 μl, 1 μl εξάνιο, αναρροφούνται
0,5 μl αέρα και έπειτα 0,5-1 μl του διαλύματος του δείγματος· επίσης
τραβιέται το έμβολο της σύριγγας έτσι ώστε η βελόνα να είναι κενή.
Εισάγεται η βελόνα μέσω της μεμβράνης του συστήματος έγχυσης και,
μετά από 1-2 δευτερόλεπτα, εγχύεται γρήγορα και ύστερα βγαίνει η
βελόνα αργά, μετά από 5 δευτερόλεπτα περίπου.
5.4.3.2. Η καταγραφή προχωρά μέχρι την πλήρη έκλουση των TMSE των
παρουσών στερολών.
Η γραμμή βάσεως πρέπει πάντα να πληροί τις απαιτούμενες προϋποθέ-
σεις (5.4.1.2).
5.4.4. Ταυτοποίηση των κορυφών
Η ταυτοποίηση των κορυφών πραγματοποείται με βάση το χρόνο κατα-
κράτησης και σε σύγκριση με το μείγμα των TMSE των στερολών,
αναλυόμενων υπό τις ίδιες συνθήκες.
Οι στερόλες εκλούονται με την ακόλουθη σειρά: χοληστερόλη, βρασι-
καστερόλη, ►C1 24-μεθυλενο ◄-χοληστερόλη, καμπεστερόλη,
καμπεστανόλη, στιγμαστερόλη, Δ7 καμπεστερόλη, Δ5, 23 στιγμασταδιε-
νόλη, ►C1 κλεροστερόλη ◄, Β-σιτοστερόλη, σιτοστανόλη, Δ5-αβενα-
στερόλη, 5,24 στιγμασταδιενόλη, Δ7-στιγμαστενόλη, Δ7-αβεναστερόλη.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 44
Στον πίνακα I αναφέρονται οι χρόνοι κατακράτησης οι σχετικοί με τη
σιτοστερόλη για τις στήλες SE 52 και SE 54.
Τα σχήματα 1 και 2 παρουσιάζουν τα τυπικά χρωματογραφήματα μερι-
κών ελαίων.
5.4.5. Ποσοτική αξιολόγηση
5.4.5.1. Πραγματοποιείται, με τον ολοκληρωτή, ο υπολογισμός του εμβαδού των
κορυφών της α-χολεστανόλης και των στερολών. Να μην λαμβάνονται
υπόψη οι πιθανές κορυφές των συστατικών που δεν περιέχονται σε αυτά
που αριθμούνται στον πίνακα I. Ο ανάλογος συντελεστής για την α-
χολεστανόλη πρέπει να είναι ίσος με 1.
5.4.5.2. Υπολογίζεται η συγκέντρωση κάθε στερόλης ξεχωριστά σε mg/100 g
λιπαρής ουσίας, ως ακολούθως:
στερόληX ¼ Ax ·m s·100
As ·m
όπου:
Ax = εμβαδόν της κορυφής της στερόλης x ►M6
_______ ◄,
As = εμβαδόν της κορυφής της α-χολεστανόλης ►M6
_______ ◄,
ms = βάρος της α-χολεστανόλης που προσετέθη, σε χιλιοστά του γραμ-
μαρίου,
μ = βάρος του δείγματος που λήφθηκε για τον προσδιορισμό, σε
γραμμάρια.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
6.1. Αναφέρονται οι συγκεντρώσεις για καθεμία από τις στερόλες ξεχωριστά
σε mg/100 g λιπαρής ουσίας, και το άθροισμα τους ως «ολικές στερό-
λες».
6.2. Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία κάθε μεμονωμένης στερόλης από
το λόγο του εμβαδού της αντίστοιχης κορυφής προς το άθροισμα των
εμβαδών των κορυφών των στερολών.
% στερόλης x ¼ AxP
A
� 100
όπου:
Ax = εμβαδόν της κορυφής x,
∑A = άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 45
ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ I
Προσδιορισμός της γοαμμικής ταχύτητας του αερίου
Στο χρωματογράφο αέριας φάσης, ρυθμισμένο στς κανονικές συνθήκες λειτουργί
ας, εγχέονται 1 έως 3 μl μεθάνιου (ή προπάνιου) και χρονομετράται ο χρόνος
που χρειάζεται το αέριο για να διασχίσει τη στήλη, από τη στιγμή της έγχυσης
έως την εμφάνιση της κορυφής (tM).
Η γραμμική ταχύτητα σε cm/s δίνεται από τη σχέση L/tM, όπου L είναι το μήκος
της στήλης σε εκατοστά και tM ο χρονομετρημένος χρόνος σε δευτερόλεπτα.
Πίνακας I
Σχετικοί χρόνοι κατακράτησης των στερολών
Κορυφ-
ή
Ταυτοποίηση
Σχετικός χρόνος κατα-
κράτησης
Στήλη SE
Στήλη SE
1 χοληστερόλη Δ5-χοληστεν-3β-ολη 0,67 0,63
2 ►C1 χολεστανόλη◄ 5α-χολησταν-3β-ολη 0,68 0,64
3 βρασσικαστερόλη [24S]-24-μεθυλ-Δ5,22-χολεσταδιεν-
3β-ολη
0,73 0,71
4 24-μεθυλένιο χοληστε-
ρόλη
24-μεθυλένιο,Δ5,24-χολεσταδιεν-3β-
ολη
0,82 0,80
5 καμπεστερόλη [24R]-24-μεθυλ-Δ5χοληστεν-3β-όλη 0,83 0,81
6 καμπεστανόλη [24]24-μεθυλ-χολησταν-3β-ολη 0,85 0,82
7 στιγμαστερόλη [24S]-24-αιθυλ-Δ5,22-χολεσταδιεν-
3β-ολη
0,88 0,87
8 Δ7-καμπεστερόλη [24R]-24-μεθυλ-Δ7-χοληστεν-3β-ολη 0,93 0,92
9 Δ5,23-στιγμασταδιενόλη [24R,S]-24-αιθυλ-Δ5,23-χολεσταδιεν-
3β-ολη
0,95 0,95
10 ►C1 κλεροστερόλη◄ [24S]-24-αιθυλ-Δ5,25-χολεσταδιεν-
3β-ολη
0,96 0,96
11 β-σιτοστερόλη [24R]-24-αιθυλ-Δ5-χολεσταν-3β-ολη 1,00 1,00
12 σιτοστανόλη 24-αιθυλ-χολησταν-3β-ολη 1,02 1,02
13 Δ5-αβεναστερόλη [24Z]-24-αιθυλιδεν-Δ5-χολησταν-3β-
ολη
1,03 1,03
14 Δ5,24 στιγμαστα-διενόλη [24R,S]-24-αιθυλ-Δ5,24-χολεσταδιεν-
3β-ολη
1,08 1,08
15 Δ7-στιγμαστενόλη [24R,S]-24-αιθυλ-Δ7,24-χολεσταδιεν-
3β-ολη
1,12 1,12
16 ►C1 17-αβεναστε-
ρόλη◄
[24Z]-24-αιθυλιδεν-Δ7-χολεστεν-3β-
ολη
1,16 1,16
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 46
Σχήμα 1
Χρωματογραφία αέριας φάσης του στερολικού κλάσματος ακατέργαστου ελαιολάδου
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 47
Σχήμα 2
Χρωματογραφία αέριας φάσης του στερολικού κλάσματος εξευγενισμένου ελαιολάδου
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 48
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΡΥΘΡΟΔΙΟΛΗΣ ΚΑΙ ΟΥΒΑΟΛΗΣ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η ερυθροδιόλη (συνήθως γνωστή ως η διόλη ερυθροδιόλη μαζί με τη
διόλη ουβαόλη) είναι ένα συστατικό του μη σαπωνοποιήσιμου κλάσμα-
τος, χαρακτηριστικού ορισμένων τύπων λιπαρών ουσιών. Συναντάται σε
σημαντικά υφηλότερες συγκεντρώσεις σε ελαιόλαδο εξ εκχυλίσεως από
ό,τι σε άλλα έλαια, (όπως ελαιόλαδο εξ εκθλίψεως και έλαιο σταφυλό-
σπορου, τα οποία την περιέχουν επίσης) και επομένως η παρουσία της
μπορεί να υποδηλώνει τη παρουσία ελαιόλαδου εξ εκχυλίσεως.
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η μέθοδος περιγράφει μία διαδικασία ανίχνευσης ερυθροδιόλης σε λιπα-
ρές ουσίες.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Η λιπαρή ουσία σαπωνοποιείται με υδροξείδιο του καλίου σε αιθανολικό
διάλυμα. Το μη σαπωνοποιήσιμο κλάσμα εκχυλίζεται κατόπιν με αιθυλικό
αιθέρα και καθαρίζεται με διέλευση μέσα από στήλη αλουμίνας.
Τα μη σαπωνοποιήσιμα μέρη υπόκεινται σε χρωματογραφία λεπτής στοι-
βάδας σε πλάκα διοξείδιου του πυρίτιου έως ότου διαχωριστούν οι στοι-
βάδες που αντιστοιχούν στα κλάσματα στερολών και ερυθροδιόλης. Οι
επανακτούμενες από την πλάκα στερόλες και η ερυθροδιόλη μετατρέπο-
νται σε τριμεθυλοσιλυλοαιθέρες και το μείγμα αναλύεται με αέρια χρω-
ματογραφία.
Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως το ποσοστό ερυθροδιόλης στο μείγμα
ερυθροδιόλης και στερολών.
3. ΟΡΓΑΝΑ
3.1. Τα όργανα περιγράφονται στο παράρτημα V (προσδιορισμός της περιε-
κτικότητας σε στερόλες).
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Τα αντιδραστήρια περιγράφονται στο παράρτημα V (προσδιορισμός της
περιεκτικότητας σε στερόλες).
4.2. Διάλυμα αναφοράς ερυθροδιόλης, διάλυμα 0,5 % σε χλωροφόρμιο.
5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
5.1. Προπαρασκευή των ασαπωνοποιήτων.
Όπως περιγράφεται στη παράγραφο 5.1.2. του παραρτήματος V.
5.2. Διαχωρισμός της ερυθροδιόλης και των στερολών.
5.2.1. Βλέπε παράγραφο 5.2.1 της μεθόδου του παραρτήματος V.
5.2.2. Βλέπε παράγραφο 5.2.2 της ανωτέρω μεθόδου.
5.2.3. Παρασκευάζεται διάλυμα 5 % των ασαπωνοποιήτων σε χλωροφόρμιο.
Χρησιμοποιώντας τη μικροσύριγγα του 0,1 ml, στρώνεται μία χρωματο-
γραφική πλάκα με 0,3 ml διαλύματος περίπου 1,5 cm από το κατώτερο
άκρο σε μία γραμμή κατά το δυνατό λεπτή και ομοιόμορφη. Στη μία άκρη
της πλάκας τοποθετούνται λίγα μικρολίτρα από τα διαλύματα χολεστερό-
λης και ερυθροδιόλης ως αναφορά.
5.2.4. Η πλάκα τοποθετείται μέσα στο θάλαμο ανάπτυξης που έχει προετοιμα-
στεί κατά τα καθοριζόμενα στην 5.2.1. Η θερμοκρασία του περιβάλλοντος
πρέπει να είναι περίπου 20 °C. Ο θάλαμος κλείνεται αμέσως με το
κάλυμμα και αφήνεται να γίνει έκλουση έως ότου το μέτωπο του διαλύτη
φτάσει σε απόσταση περίπου 1 cm από το ανώτερο άκρο της πλάκας.
Κατόπιν η πλάκα απομακρύνεται από το θάλαμο ανάπτυξης και ο διαλύ-
της εξατμίζεται σε ρεύμα θερμού αέρα.
5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και ομοιόμορφα με το αλκοολικό διάλυμα της
►C1 2-7 διχλωροφλουορεσκεΐνης ◄. Όταν η πλάκα παρατηρείται υπό
υπεριώδες φώς, οι στοίβαδες των στερολών και της ερυθροδιόλης μπο-
ρούν να αναγνωρισθούν από την ευθυγράμμισή τους με τις κηλίδες ανα-
φοράς. Τα όρια της περιοχής φθορισμού σημαίνονται με ένα σημάδι μόλις
έξω από αυτά.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 49
5.2.6. Χρησιμοποιώντας μία μεταλλική σπάτουλα, αποξέεται το πήγμα διοξεί-
διου του πυρίτιου εντός των σημανθέντων περιοχών από τη πλάκα και
μεταφέρεται σε φιάλη των 50 ml. Προστίθενται 15 ml θερμού χλωροφόρ-
μιου, αναδεύονται καλά και διηθούνται μέσα από χωνί με διάτρητο γυά-
λινο δίσκο, έτσι ώστε το πήγμα του διοξείδιου του πυρίτιου να μεταφερθεί
στον ηθμό. Εκπλύεται τρείς φορές με θερμό χλωροφόρμιο (10 ml κάθε
φορά), συλλέγοντας το διήθημα σε φιάλη των 100 ml. Το διήθημα συμπυ-
κνώνεται μέχρις όγκου 4-5 ml, μεταφέρεται σε βαθμονομημένο σωλήνα
φυγοκέντρησης των 10 ml, με κωνικό πυθμένα, ξηραίνεται με ήπια θέρ-
μανση σε ρεύμα αζώτου και ζυγίζεται.
5.3. Παρασκευή των τριμεθυλοσιλυλοαιθέρων.
Όπως περιγράφεται στη παράγραφο 5.3 της μεδόδου που παραρτήματος
V.
5.4. Αέρια χρωματογραφική ανάλυση.
Όπως περιγράφεται στη παράγραφο 5.4 της ανωτέρω μεθόδου.
Οι συνθήκες εκτέλεσης της αέριας χρωματογραφικής ανάλυσης πρέπει να
είναι τέτοιες ώστε να εκτελείται η ανάλυση των στερολών και να διαχω-
ρίζονται οι ΤΜΣΕ από την ερυθροδιόλη και την ουβαόλη.
Από τη στιγμή που το δείγμα έχει εγχυθεί, η καταγραφή συνεχίζεται έως
ότου εκλουσθούν οι υπάρχουσες στερόλες, η ερυθροδιόλη και η ουβαόλη.
Μετά αναγνωρίζονται οι κορυφές (οι χρόνοι κατακράτησης της ερυθρο-
διόλης και ουβαόλης αναφορικά πρός τη β-σιτοστερόλη είναι περίπου 1,4
και 1,55 αντίστοιχα) και υπολογίζονται τα εμβαδά σχετικά με τις στερό-
λες.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Ερυθροδιόλη % ¼ A1 þ A2
A1 þ A2 þ
P
Aστερολών
� 100
όπου:
A1 = εμβαδό κορυφής ερυθροδιόλης ►M6
_______ ◄,
A2 = εμβαδό κορυφής ουβαόλης ►M6
_______ ◄,
∑Aστερολών = ολικό εμβαδό κορυφών στερολών ►M6
_______ ◄.
Το αποτέλεσμα εκφράζεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 50
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VII
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΚΑΤΟΣΤΙΑΙΑΣ ΑΝΑΛΟΓΙΑΣ 2-
ΜΟΝΟΠΑΛΜΙΤΙΝΗΣ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται η αναλυτική διαδικασία για τον
προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας παλμιτικού οξέος στη θέση
2 των τριγλυκεριδίων μέσω της εκτίμησης της 2-μονοπαλμιτίνης.
Η παρούσα μέθοδος έχει εφαρμογή στα φυτικά έλαια που είναι υγρά σε
θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 °C).
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Μετά την παρασκευή του, το δείγμα ελαιολάδου υφίσταται την επίδραση
παγκρεατικής λιπάσης: λόγω μερικής και εξειδικευμένης υδρόλυσης στις
θέσεις 1 και 3 του μορίου του τριγλυκεριδίου, σχηματίζονται μονογλυ-
κερίδια στη θέση 2. Μετά από σιλυλίωση (σιλανοποίηση), προσδιορίζε-
ται η εκατοστιαία αναλογία 2-μονοπαλμιτίνης στο κλάσμα των μονογλυ-
κεριδίων με αέρια χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.
3. ΣΥΝΗΘΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ
3.1. Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml
3.2. Ποτήρια ζέσεως των 100, 250 και 300 ml
3.3. Γυάλινη χρωματογραφική στήλη, εσωτερικής διαμέτρου 21-23 mm και
μήκους 400 mm, εφοδιασμένη με πλάκα από συντετηγμένο γυαλί και
στρόφιγγα
3.4. Ογκομετρικοί κύλινδροι των 10, 50, 100 και 200 ml
3.5. Σφαιρικές φιάλες των 100 και 250 ml
3.6. Περιστροφικός εξατμιστήρας
3.7. Σωλήνες φυγοκέντρου των 10 ml, με κωνικό πυθμένα και εσμυρισμένο
πώμα
3.8. Φυγόκεντρος για σωλήνες των 10 και 100 ml
3.9. Θερμοστάτης ικανός να διατηρεί τη θερμοκρασία στους 40 ± 0,5 °C
3.10. Βαθμολογημένα σιφώνια του 1 και των 2 ml
3.11. Υποδερμική σύριγγα του 1 ml
3.12. Μικροσύριγγα των 100 μl
3.13. Διαχωριστική χοάνη των 1 000 ml
3.14. Αεριοχρωματογράφος για τριχοειδείς στήλες, εφοδιασμένος με σύστημα
έγχυσης εν ψυχρώ «on column» για απευθείας εισαγωγή του δείγματος
στη στήλη και με κλίβανο ικανό να διατηρεί την επιλεγόμενη θερμο-
κρασία με ακρίβεια 1 °C
3.15. Σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ «on column» για απευθείας εισαγωγή του
δείγματος στη στήλη
3.16. Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας και ηλεκτρόμετρο
3.17. Καταγραφέας-ολοκληρωτής κατάλληλος για το ηλεκτρόμετρο, με χρόνο
απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και με μεταβλητή
ταχύτητα χαρτιού
3.18. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους
8 έως 12 μέτρων, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επικαλυμ-
μένη με μεθυλοπολυσιλοξάνιο ή φαινυλοπολυσιλοξάνιο 5 %, πάχους
0,10 έως 0,30 μm, με δυνατότητα χρήσης στους 370 °C
3.19. Μικροσύριγγα των 10 μl για την απευθείας εισαγωγή στη στήλη, μήκους
τουλάχιστον 7,5 cm, με συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού μεταξύ 0,063
και 0,200 mm (70/280 mesh), που παρασκευάζεται ως εξής: τοποθετείται
η silica gel σε κάψα από πορσελάνη, ξηραίνεται στο πυριατήριο στους
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 51
160 °C επί 4 ώρες και, κατόπιν, αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία
περιβάλλοντος μέσα σε ξηραντήρα. Προστίθεται ποσότητα νερού ίση με
5 % του βάρους του silica gel ως εξής: σε φιάλη Erlenmeyer των 500 ml
ζυγίζονται 152 g silica gel και προστίθενται 8 g απεσταγμένου νερού. Η
φιάλη πωματίζεται και το σύνολο ανακινείται ήπια, ώστε να επιτευχθεί
ομοιογενής κατανομή του νερού, και αφήνεται σε ηρεμία τουλάχιστον
επί 12 ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.
4.2. n-εξάνιο (χρωματογραφικής καθαρότητας)
4.3. Ισοπροπανόλη
4.4. Υδατικό διάλυμα ισοπροπανόλης 1:1 (κ.ό.)
4.5. Παγκρεατική λιπάση. Η δραστικότητα της χρησιμοποιούμενης λιπάσης
πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 2,0 και 10 μονάδων λιπάσης ανά mg. (Στο
εμπόριο κυκλοφορούν παγκρεατικές λιπάσες με δραστικότητα 2,0 έως 10
μονάδων ανά mg ενζύμου.)
4.6. Ρυθμιστικό διάλυμα τρις-υδροξυ-μεθυλαμινομεθανίου: υδατικό διάλυμα
1 Μ, του οποίου το pH ρυθμίζεται στην τιμή 8 (ποτενσιομετρικός έλεγ-
χος) με πυκνό HCI (1:1 κ.ό.)
4.7. Χολικό νάτριο ενζυματικής καθαρότητας, υδατικό διάλυμα 0,1 % (το
διάλυμα αυτό πρέπει να χρησιμοποιείται εντός 15 ημερών από την παρα-
σκευή του)
4.8. Χλωριούχο ασβέστιο, υδατικό διάλυμα 22 %
4.9. Διαιθυλαιθέρας για χρωματογραφία
4.10. Διαλύτης ανάπτυξης: μείγμα η-εξανίου και διαιθυλαιθέρα 87:13 (κ.ό.)
4.11. Υδροξείδιο του νατρίου, διάλυμα 12 % κ.β.
4.12. Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυμα 1 % σε αιθανόλη
4.13. Φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο για αέρια χρωματογραφία
4.14. Βοηθητικά αέρια: – υδρογόνο, καθαρότητας τουλάχιστον 99 %, απαλ-
λαγμένο υγρασίας και οργανικών ουσιών – και αέρας της ίδιας καθαρό-
τητας, για αέρια χρωματογραφία
4.15. Αντιδραστήριο σιλυλίωσης: μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλοδισιλαζανίου-
τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9:3:1 (κ.ό.) (Στο εμπόριο κυκλοφορούν έτοιμα
διαλύματα. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα αντιδραστήρια
σιλυλίωσης, όπως π.χ. δις-τριμεθυλοσιλυλοτριφθορακεταμίδιο + 1 % τρι-
μεθυλοχλωροσιλάνιο, αραιωμένα με ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης.)
4.16. Ουσίες αναφοράς: καθαρά μονογλυκερίδια ή μείγματα μονογλυκεριδίων
γνωστής εκατοστιαίας σύστασης, ανάλογης με τη σύσταση του δείγμα-
τος.
5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
5.1. Προετοιμασία του δείγματος
5.1.1. Τα έλαια με περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα κάτω του 3 % δεν χρειά-
ζεται να εξουδετερώνονται πριν από τη χρωματογραφία σε στήλη silica
gel. Τα έλαια των οποίων η περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα υπερβαίνει
το 3 % πρέπει να εξουδετερώνονται σύμφωνα με το σημείο 5.1.1.1.
5.1.1.1. Στη διαχωριστική χοάνη των 1 000 ml (3.13) φέρονται 50 g ελαίου και
200 ml n-εξανίου. Προστίθενται 100 ml ισοπροπανόλης και ποσότητα
διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 12 % (4.11) η οποία αντιστοιχεί
στην περιεκτικότητα του ελαίου σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, προσαυξη-
μένη κατά 5 %. Το σύνολο αναδεύεται ζωηρά επί ένα λεπτό, προστίθε-
νται 100 ml απεσταγμένου νερού, αναδεύεται πάλι και αφήνεται σε
ηρεμία.
Μετά το διαχωρισμό, απορρίπτεται η κατώτερη στιβάδα που περιέχει
τους σάπωνες και απομακρύνονται οι πιθανές ενδιάμεσες στιβάδες
(βλέννες και αδιάλυτες ουσίες). Το εξανικό διάλυμα του εξουδετερωμέ-
νου ελαίου εκπλύνεται με διαδοχικές δόσεις 50-60 ml διαλύματος ισο-
προπανόλης σε νερό 1:1 (κ.ό.) (4.4) μέχρι να εξαφανιστεί το ρόδινο
χρώμα της φαινολοφθαλεΐνης.
Απομακρύνεται το μεγαλύτερο μέρος του εξανίου με απόσταξη υπό κενό
(χρησιμοποιείται π.χ. περιστροφικός εξατμιστήρας) και το έλαιο μεταγ-
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 52
γίζεται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml (3.5) και ξηραίνεται υπό κενό
μέχρι να απομακρυνθεί τελείως ο διαλύτης.
Μετά το τέλος της εργασίας αυτής, η οξύτητα του ελαίου πρέπει να είναι
μικρότερη από 0,5 %.
5.1.2. Σε φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1) φέρεται 1,0 g του ανωτέρω παρα-
σκευάσματος ελαίου και διαλύεται σε 10 ml μείγματος ανάπτυξης (4.10).
Το διάλυμα αφήνεται σε ηρεμία τουλάχιστον επί 15 λεπτά πριν από τη
χρωματογραφία σε στήλη silica gel.
Εάν το διάλυμα είναι θολό, φυγοκεντρείται ώστε να εξασφαλιστούν
άριστες συνθήκες για τη χρωματογραφία. (Μπορούν να χρησιμοποιηθούν
έτοιμες φύσιγγες silica gel SPE των 500 mg).
5.1.3. Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης
Προστίθενται στη στήλη (3.3) περίπου 30 ml διαλύτη ανάπτυξης (4.10).
Με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου εισάγεται στο κατώτερο τμήμα της ένα
τεμάχιο βάμβακα και πιέζεται για να αφαιρεθεί ο αέρας.
Σε ποτήρι ζέσεως παρασκευάζεται εναιώρημα 25 g silica gel (4.1) σε
περίπου 80 ml διαλύτη ανάπτυξης και προστίθεται στη στήλη με τη
βοήθεια διαχωριστικής χοάνης.
Εξακριβώνεται ότι έχει εισέλθει στη στήλη το σύνολο του silica gel.
Μετά από έκπλυση με τον διαλύτη ανάπτυξης (4.10), ανοίγεται η στρό-
φιγγα της στήλης και το υγρό αφήνεται να εκρεύσει έως ότου η στάθμη
του να βρίσκεται περίπου 2 mm πάνω από το silica gel.
5.1.4. Χρωματογραφία στήλης
Σε φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1), ζυγίζεται ακριβώς 1,0 g δείγματος
που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1.
Το δείγμα διαλύεται σε 10 ml διαλύτη ανάπτυξης (4.10). Το διάλυμα
προστίθεται στη χρωματογραφική στήλη που έχει ετοιμαστεί σύμφωνα
με το σημείο 5.1.3, ενώ λαμβάνεται μέριμνα ώστε να μην ανακινηθεί η
επιφάνεια της στήλης.
Ανοίγεται η στρόφιγγα και το διάλυμα του δείγματος αφήνεται να εκρεύ-
σει έως ότου η στάθμη του εξισωθεί με τη στάθμη του silica gel. Ακο-
λουθεί ανάπτυξη με 150 ml διαλύματος ανάπτυξης. Η ταχύτητα ροής
ρυθμίζεται σε 2 ml/min (έτσι ώστε τα 150 ml να εκρεύσουν από τη
στήλη εντός 60-70 λεπτών περίπου).
Το έκλουσμα συλλέγεται σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη των 250 ml.
Εξατμίζεται ο διαλύτης υπό κενό και απομακρύνονται τα τελευταία ίχνη
του με διαβίβαση ρεύματος αζώτου.
Ζυγίζεται η σφαιρική φιάλη και υπολογίζεται το εκχύλισμα που συλλέ-
χθηκε.
[Σε περίπτωση χρήσης έτοιμων φυσίγγων silica gel SPE, ακολουθείται η
εξής διαδικασία:
Μετά την ετοιμασία των φυσίγγων με 3 ml n-εξανίου, προστίθεται σε
αυτές 1 ml διαλύματος (5.1.2).
Μετά τη διήθηση του διαλύματος, ακολουθεί ανάπτυξη με 4 ml μείγμα-
τος η-εξανίου και διαιθυλαιθέρα 9:1 (κ.ό.).
Το έκλουσμα συλλέγεται σε σωλήνα των 10 ml και συμπυκνώνεται
μέχρι ξηρού με διαβίβαση ρεύματος αζώτου.
Το ξηρό υπόλειμμα υφίσταται την επίδραση παγκρεατικής λιπάσης (5.2).
Είναι θεμελιώδους σημασίας η εξακρίβωση της σύστασης σε λιπαρά
οξέα πριν και μετά τη διέλευση από τη φύσιγγα SPE].
5.2. Υδρόλυση με παγκρεατική λιπάση
5.2.1. Στον σωλήνα φυγοκέντρου ζυγίζεται 0,1 g ελαίου που έχει παρασκευα-
στεί σύμφωνα με το σημείο 5.1. Προστίθενται 2 ml ρυθμιστικού διαλύ-
ματος (4.6), 0,5 ml διαλύματος χολικού νατρίου (4.7) και 0,2 ml διαλύ-
ματος χλωριούχου ασβεστίου με καλή ανάδευση μετά από κάθε προ-
σθήκη. Κλείνεται ο σωλήνας με το εσμυρισμένο πώμα και τοποθετείται
στον θερμοστάτη στους 40 ± 0,5 °C.
5.2.2. Προστίθενται 20 mg λιπάσης, το σύνολο αναδεύεται επιμελώς (χωρίς να
διαβραχεί το πώμα) και τοποθετείται στον θερμοστάτη επί 2 λεπτά ακρι-
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 53
βώς. Στη συνέχεια ο σωλήνας αποσύρεται, ανακινείται ζωηρά επί 1
λεπτό ακριβώς και αφήνεται να ψυχθεί.
5.2.3. Προστίθεται 1 ml διαιθυλαιθέρα, ο σωλήνας πωματίζεται και το αιθερικό
διάλυμα ανακινείται ζωηρά, φυγοκεντρείται και μεταφέρεται με μικρο-
σύριγγα σε καθαρό και στεγνό σωλήνα.
5.3. Παρασκευή των σιλυλοπαραγώγων και προετοιμασία της αέριας
χρωματογραφίας
5.3.1. Σε σωλήνα με κωνικό πυθμένα των 10 ml φέρονται με μικροσύριγγα 100
μl διαλύματος (5.2.3).
5.3.2. Απομακρύνεται ο διαλύτης με τη διαβίβαση ελαφρού ρεύματος, αζώτου,
προστίθενται 200 μl αντιδραστηρίου σιλυλίωσης (4.15) και ο σωλήνας
πωματίζεται και αφήνεται σε ηρεμία επί 20 λεπτά.
5.3.3. Μετά από 20 λεπτά, προστίθενται 1 έως 5 ml n-εξανίου (ανάλογα με τις
συνθήκες χρωματογραφίας): το διάλυμα που προκύπτει είναι έτοιμο για
αέρια χρωματογραφία.
5.4. Αέρια χρωματογραφία
Οι συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:
— θερμοκρασία του συστήματος έγχυσης («on column») μικρότερη από
το σημείο ζέσεως του διαλύτη (68 °C),
— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 350 °C,
— θερμοκρασία της στήλης: προγραμματισμός της θερμοκρασίας του
κλιβάνου: 60 °C επί 1 λεπτό, αύξηση 15 °C ανά λεπτό μέχρι τους
180 °C και έπειτα 5 °C ανά λεπτό μέχρι τους 340 °C, κατόπιν
340 °C επί 13 λεπτά,
— φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο, ρυθμισμένο στην κατάλληλη γραμ-
μική ταχύτητα, ώστε να επιτευχθεί η διαχωριστική ικανότητα που
αποτυπώνεται στο σχήμα 1. Ο χρόνος κατακράτησης του τριγλυκε-
ριδίου C54 πρέπει να είναι 40 ± 5 λεπτά (βλέπε σχήμα 2). (Οι
ανωτέρω συνθήκες εργασίας προτείνονται ενδεικτικά. Κάθε τεχνικός
οφείλει να τις βελτιστοποιεί για να επιτύχει την επιθυμητή διαχωρι-
στική ικανότητα. Η κορυφή που αντιστοιχεί στην 2-μονοπαλμιτίνη
πρέπει να έχει ελάχιστο ύψος 10 % της κλίμακας του καταγραφέα.),
— εγχεόμενη ποσότητα ουσίας: 0,5-1 μl του n-εξανικού διαλύματος (5
ml) (5.3.3).
5.4.1. Ταυτοποίηση των κορυφών
Τα επιμέρους μονογλυκερίδια ταυτοποιούνται βάσει των λαμβανόμενων
χρόνων κατακράτησης και με σύγκριση με τους χρόνους κατακράτησης
προτύπων μειγμάτων μονογλυκεριδίων, που αναλύθηκαν στις ίδιες συν-
θήκες.
5.4.2. Ποσοτικός προσδιορισμός
Το εμβαδόν κάθε κορυφής υπολογίζεται με ηλεκτρονικό ολοκληρωτή.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Η εκατοστιαία αναλογία 2-μονοπαλμιτίνης υπολογίζεται από τον λόγο
του εμβαδού της αντίστοιχης κορυφής προς το άθροισμα των εμβαδών
των κορυφών όλων των μονογλυκεριδίων (βλέπε σχήμα 2), σύμφωνα με
τον τύπο:
glyceryl monopalmitate (%):
Ax
ΣΑ
� 100
όπου:
Ax = το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στη 2-μονοπαλμιτίνη,
ΣΑ = το άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών που αντιστοιχούν
σε μονογλυκερίδια.
Το αποτέλεσμα πρέπει να εκφράζεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.
7. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
Στην έκθεση της ανάλυσης θα πρέπει να αναφέρονται τα εξής:
— παραπομπή στη παρούσα μέθοδο,
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 54
— κάθε στοιχείο απαραίτητο για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγματος,
— το αποτέλεσμα της ανάλυσης,
— κάθε παρέκκλιση από την παρούσα μέθοδο, ανεξαρτήτως του εάν
έχει αποφασιστεί από τα ενδιαφερόμενα μέρη ή οφείλεται σε άλλους
λόγους,
— στοιχεία ταυτότητας του εργαστηρίου, ημερομηνία της ανάλυσης και
υπογραφή των υπευθύνων γι’ αυτή.
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 55
Σχήμα 1
Χρωματογράφημα των προϊόντων της αντίδρασης σιλυλίωσης που προέκυψαν από την επί-
δραση λιπάσης σε εξευγενισμένο ελαιόλαδο, στο οποίο είχε προστεθεί 20 % εστεροποιημένο
έλαιο (100 %)
Key: «acides gras libres» = free fatty acids; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» =
refined olive oil + 20 % esterified oil; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitolein; «1-2 mono
C18 insat.» = unsaturated 1-2 mono C18
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 56
Σχήμα 2
Χρωματογράφημα:
A) μη εστεροποιημένου ελαιόλαδου, μετά από την επίδραση λιπάσης και από σιλυλίωση· στις
συνθήκες αυτές (τριχοειδής στήλη 8-12 m), το κλάσμα των κηρών εκλούεται ταυτόχρονα
με το κλάσμα των διγλυκεριδίων ή λίγο αργότερα.
Μετά την επίδραση της λιπάσης, η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια δεν θα πρέπει να
υπερβαίνει το 15 %
Υπόμνημα:
1 = Ελεύθερα λιπαρά οξέα
2 = Μονογλυκερίδια
3 = Διγλυκερίδια
4 = Τριγλυκερίδια
* = 2-μονοπαλμιτίνη
** = Τριγλυκερίδιο C54
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 57
Χρωματογράφημα:
B) εστεροποιημένου ελαίου, μετά από την επίδραση λιπάσης και από σιλυλίωση· στις συν-
θήκες αυτές (τριχοειδής στήλη 8-12 m), το κλάσμα των κηρών εκλούεται ταυτόχρονα με
το κλάσμα των διγλυκεριδίων ή λίγο αργότερα.
Μετά την επίδραση της λιπάσης, η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια δεν θα πρέπει να
υπερβαίνει το 15 %.
Υπόμνημα:
1 = Ελεύθερα λιπαρά οξέα
2 = Μονογλυκερίδια
3 = Διγλυκερίδια
4 = Τριγλυκερίδια
* = 2-μονοπαλμιτίνη
** = Τριγλυκερίδιο C54
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 58
8. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ
Σημείωση 1. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ
Στο εμπόριο κυκλοφορούν λιπάσες ικανοποιητικής δραστικό-
τητας. Είναι επίσης δυνατή η εργαστηριακή παρασκευή τους
ως εξής:
Ψύχονται 5 kg νωπού παγκρέατος χοίρου στους 0 °C. Το
πάγκρεας απαλλάσσεται από το στερεό λίπος και τον συνδε-
τικό ιστό που το περιβάλλουν και αλέθεται σε μικροτεμαχι-
στή με λεπίδες μέχρι να ληφθεί ρευστός πολτός. Ο πολτός
αυτός αναδεύεται επί 4-6 ώρες με 2,5 λίτρα άνυδρης ακετό-
νης και κατόπιν φυγοκεντρείται. Το υπόλειμμα εκχυλίζεται
τρεις φορές ακόμα με τον ίδιο όγκο άνυδρης ακετόνης και,
έπειτα, δύο φορές με μείγμα ακετόνης και διαιθυλαιθέρα 1:1
(κ.ό.) και δύο φορές με διαιθυλαιθέρα.
Το υπόλειμμα ξηραίνεται υπό κενό επί 48 ώρες για να ληφθεί
σταθερή σκόνη, η οποία διατηρείται για μεγάλο χρονικό διά-
στημα στο ψυγείο, προφυλαγμένη από την υγρασία.
Σημείωση 2. ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ
Παρασκευάζεται γαλάκτωμα ελαιολάδου ως εξής:
Αναδεύεται σε αναμικτήρα επί 10 λεπτά μείγμα 165 ml δια-
λύματος αραβικού κόμμεως 100 g/l, 15 g θρυμματισμένου
πάγου και 20 ml εξουδετερωμένου ελαιολάδου.
Σε ποτήρι ζέσεως των 50 ml εισάγονται διαδοχικά 10 ml του
εν λόγω γαλακτώματος, 0,3 ml διαλύματος χολικού νατρίου
0,2 g/ml και 20 ml απεσταγμένου νερού.
Το ποτήρι τοποθετείται σε θερμοστάτη, ρυθμισμένο στους
37 °C, και εισάγονται τα ηλεκτρόδια του πεχάμετρου και ο
ελικοειδής αναδευτήρας.
Προστίθεται στάγδην, με προχοΐδα, διάλυμα υδροξειδίου του
νατρίου 0,1 N μέχρι να επιτευχθεί pH 8,3.
Προστίθεται μια ποσότητα αιωρήματος σκόνης λιπάσης σε
νερό (0,1 g/ml λιπάσης). Όταν η ένδειξη του πεχάμετρου
είναι 8,3, τίθεται σε λειτουργία το χρονόμετρο και προστίθε-
ται στάγδην διάλυμα υδροξειδίου νατρίου με το ρυθμό που
απαιτείται για να διατηρηθεί το pH στην τιμή 8,3. Σημειώνε-
ται ανά λεπτό ο όγκος διαλύματος που καταναλώνεται.
Σχεδιάζεται γραφική παράσταση των δεδομένων σε ορθογώ-
νιο σύστημα αξόνων, με τετμημένη τους χρόνους και τεταγ-
μένη τα ml αλκαλικού διαλύματος 0,1 N που καταναλώθηκαν
για να διατηρηθεί το pH σταθερό. Πρέπει να προκύπτει γραμ-
μική καμπύλη.
Η δραστικότητα της λιπάσης, μετρούμενη σε μονάδες λιπά-
σης ανά mg, παρέχεται από τον ακόλουθο τύπο:
A ¼ V � N � 100
m
όπου:
A = η δραστικότητα σε μονάδες λιπάσης/mg,
V = τα χιλιοστόλιτρα διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου
0,1 N που καταναλώνονται ανά λεπτό (υπολογιζόμενα
από την καμπύλη),
N = η κανονικότητα του διαλύματος υδροξειδίου του
νατρίου,
m = η μάζα της ελεγχόμενης λιπάσης, σε mg.
Ως μονάδα λιπάσης ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που
ελευθερώνει 10 μικρογραμμοϊσοδύναμα οξέος ανά λεπτό.
▼M20
_______
▼M21
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 59
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IX
ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ►C1 ΑΝΑΛΥΣΗ ◄ ΣΤΟ ΥΠΕΡΙΩΔΕΣ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η φασματοφωτομετρική εξέταση στο υπεριώδες μπορεί να δώσει ►C1
πληροφορίες ◄ ως προς την ποιότητα ενός λίπους, την κατάσταση συντή-
ρησής του και τις μεταβολές που έχουν επέλθει ►C1 τις οφειλόμενες σε
τεχνολογικές διαδικασίες ◄.
Η απορρόφηση στα μήκη κύματος που καθορίζονται στη μέθοδο οφείλεται
στη παρουσία ►C1 συζυγιακών συστημάτων ◄ διένιων και τριένιων. Οι
απορροφήσεις αυτές εκφράζονται ως ειδικές αποσβέσεις E1 cm 1 % (η
απόσβεση διαλύματος 1 % του λίπους στον ορισμένο διαλύτη, σε πάχος
1 cm) συμβατικά παριστώμενες με K (που ονομάζεται επίσης συντελεστής
αποσβέσεως).
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η μέθοδος περιγράφει τη διαδικασία εκτέλεσης φασματοφωτομετρικής εξέ-
τασης λιπών στο υπεριώδες.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Το υπό εξέταση λίπος διαλύεται στον απαιτούμενο διαλύτη και μετά προ-
σδιορίζεται η απόσβεση του διαλύματος στα καθοριζόμενα μήκη κύματος
αναφορικά προς καθαρό διαλύτη. Οι ειδικές αποσβέσεις υπολογίζονται από
τις φασματοφωτομετρικές αναγνώσεις.
3. ΟΡΓΑΝΑ
3.1. Φασματοφωτόμετρο πρός μέτρηση αποσβέσεων στο υπεριώδες μεταξύ 220
και 360 nm, με δυνατότητα ανάγνωσης αυτόνομων νανομετρικών μονάδων.
3.2. Ορθογώνιες κυψελίδες από χαλαζία, με καλύμματα, οπτικού μήκους 1 cm.
Όταν είναι γεμάτες με νερό ή άλλο κατάλληλο διαλύτη, οι κυψελίδες δεν
πρέπει να εμφανίζουν διαφορά μεταξύ τους μεγαλύτερη από 0,01 μονάδες
απόσβεσης.
3.3. Ογκομετρικές φιάλες των 25 ml.
▼M6
3.4. Χρωματογραφική στήλη της οποίας το επάνω μέρος έχει μήκος 270 mm και
διάμετρο 35 mm και το κάτω μέρος μήκος 270 mm και διάμετρο 10 mm.
▼B
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. — Φασματοφωτομετρικά καθαρό ισοοκτάνιο (2,2,4-τριμεθυλοπεντάνιο).
Αναφορικά προς απεσταγμένο νερό, αυτό δεν πρέπει να έχει διαπερα-
τότητα μικρότερη από 60 % στα 220 nm και μικρότερη από 95 % στα
250 nm,
ή
— φασματοφωτομετρικά καθαρό κυκλοεξάνιο: αναφορικά προς απεσταγ-
μένο νερό, αυτό δεν πρέπει να έχει διαπερατότητα μικρότερη από
40 % στα 220 nm και μικρότερη από 95 % στα 250 nm.
▼M6
_______
▼B
4.2. Βασική αλουμίνα για χρωματογραφία στήλης, προετοιμασμένη και ελεγμένη
όπως περιγράφεται στο παράρτημα I.
4.3. η-εξάνιο, για χρωματογραφία.
5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
5.1. Το υπό εξέταση δείγμα πρέπει να είναι εντελώς ομοιογενές και χωρίς υπο-
ψία ακαθαρσιών. Έλαια τα οποία είναι υγρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος
πρέπει να διηθηθούν ►C1 μέσω διηθητικού χάρτη ◄ σε θερμοκρασία
περίπου 30 °C, σκληρά λίπη πρέπει να ομοιογενοποιηθούν και να διηθηθούν
σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη από 10 °C πάνω από το σημείο τήξης.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 60
5.2. Ζυγίζονται με σχετική ακρίβεια 0,25 g του δείγματος που προετοιμάστηκε
με τον τρόπο αυτό σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml, ο όγκος συμπληρώ-
νεται έως τη χαραγή με το καθοριζόμενο διαλύτη και ομοιογενοποιείται. Το
διάλυμα που προκύπτει πρέπει να είναι εντελώς διαυγές. Αν υπάρχει αδια-
φάνεια ή θολότητα διηθείται γρήγορα ►C1 μέσω διηθητικού χάρτη ◄.
5.3. Γεμίζεται μία κυψελίδα με το αποκτηθέν διάλυμα και μετρώνται οι απορ-
ροφήσεις σε κατάλληλο μήκος κύματος μεταξύ 232 και 276 nm, λαμβάνο-
ντας το χρησιμοποιούμενο διαλύτη ως αναφορά.
Οι καταγραφόμενες τιμές απόσβεσης πρέπει να βρίσκονται μέσα στη
περιοχή 0,1-0,8. Εάν όχι, οι μετρήσεις πρέπει να επαναληφθούν, χρησιμο-
ποιώντας, κατά περίπτωση, πυκνότερα ή αραιότερα διαλύματα.
5.4. Όταν απαιτείται ένας προσδιορισμός ειδικής απόσβεσης μετά από ►C1
διέλευση από αλουμίνα ◄, εκτελείται ως εξής: Τοποθετούνται 30 g βασι-
κής αλουμίνας σε αιώρημα, σε εξάνιο, μέσα στη χρωματογραφική στήλη.
Αφού το απορροφητικό κατακαθίσει, απομακρύνεται το πλεονάζον εξάνιο
έως 1 cm περίπου πάνω από την κορυφή της αλουμίνας.
Διαλύονται 10 g του λίπους, ομοιογενοποιημένου και διηθέντος όπως περι-
γράφηκε στην 5.1, σε 100 ml εξάνιου και το διάλυμα εκχύεται μέσα στη
στήλη. Το έκλουσμα συλλέγεται και απομακρύνεται όλος ο διαλύτης υπό
κενό σε θερμοκρασία κάτω από 25 °C.
Χρησιμοποιώντας το λίπος που αποκτήθηκε με το τρόπο αυτό, προχωρούμε
αμέσως όπως καθορίστηκε στην 5.2.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
6.1. Καταγράφονται οι ειδικές αποσβέσεις (συντελεστές αποσβέσεως) στα διά-
φορα μήκη κύματος, υπολογιζόμενες ως εξής:
Kλ ¼ Eλc · s
όπου:
Kλ = ειδική απόσβεση σε μήκος κύματος λ,
Eλ = απόσβεση μετρηθείσα σε μήκος κύματος λ,
c = συγκέντρωση του διαλύματος σε g/100 ml,
σ = πάχος της κυψελίδας σε cm.
Τα αποτελέσματα εκφράζονται με δύο δεκαδικά ψηφία.
6.2. Η φασματοφωτομετρική ανάλυση ελαιόλαδου σύμφωνα με την επίσημη
μέθοδο των κανονισμών της ΕΟΚ καθορίζει τον προσδιορισμό της ειδικής
απόσβεσης σε διάλυμα ισοοκτάνιου σε μήκη κύματος 232 και 270 nm και
τον προσδιορισμό ΔΚ, ο οποίος αποδίδεται ως:
ΔΚ ¼ Km � Km � 4 þ Km þ 42
όπου Km είναι η ειδική απόσβεση σε μήκος κύματος m, το μήκος κύματος
μέγιστης απορρόφησης γύρω από τα 270 nm.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 61
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I
Προετοιμασία της αλουμίνας και έλεγχος της ενεργότητάς της
Α1.1. Π ρ ο ε τ ο ι μ α σ ί α τ η ς α λ ο υ μ ί ν α ς
Αλουμίνα, ►C1 αλουμίνα προξηρανθείσα ◄ σε φούρνο στους 380-
400 °C επί 3 ώρες, τοποθετείται σε ερμητικά κλεισμένο δοχείο, προστί-
θεται απεσταγμένο νερό σε αναλογία 5 ml ανά 100 g αλουμίνας, το
δοχείο κλείνεται αμέσως, ανακινείται επανειλημμένα και μετά αφήνεται
όπως έχει επί τουλάχιστον 12 ώρες πριν από τη χρήση.
Α1.2. Έ λ ε γ χ ο ς τ η ς ε ν ε ρ γ ό τ η τ α ς τ η ς α λ ο υ μ ί ν α ς
Προετοιμάζεται χρωματογραφική στήλη με 30 g αλουμίνας. Ενεργώντας
όπως περιγράφεται στον παράγραφο 5.4, διοχετεύεται μείγμα αποτελού-
μενο από:
— 95 % παρθένο ελαιόλαδο με ειδική απόσβεση μικρότερη από 0,18 στα
268 nm,
▼C1
— 5 % αραχιδέλαιο επεξεργασμένο σε αποχρωστικές γαίες, κατά τον
εξευγενισμό του και να έχει ειδική απόσβεση στα 268 nm ανωτέρα ή
ίση του 4.
▼B
Εάν μετά από διέλευση μέσα από τη στήλη το μείγμα έχει ειδική από-
σβεση μεγαλύτερη από 0,11 στα 268 nm, η αλουμίνα είναι αποδεκτή, εάν
όχι, πρέπει να αυξηθεί το επίπεδο ►C1 ενυδατώσεως ◄.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 62
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II
Ρύθμιση του φασματοφωτόμετρου
Α2. Ο εξοπλισμός πρέπει να ελέγχεται κατά διαστήματα (τουλάχιστον κάθε 6
μήνες) για την ανταπόκριση στα μήκη κύματος και για την ακρίβεια της
ανταπόκρισης.
Α2.1. Το μήκος κύματος μπορεί να ελεγχθεί χρησιμοποιώντας λυχνία ατμών
υδραργύρου ή με κατάλληλα φίλτρα.
Α2.2. Για να ελεγχθεί η ανταπόκριση του φωτοκύτταρου και του φωτοπολλα-
πλασιαστή, εκτελούνται τα ακόλουθα: ζυγίζονται 0,2 g καθαρού χρωμικού
καλίου για φασματοφωτομετρία, διαλύονται σε διάλυμα 0,05 N υδροξεί-
διου του καλίου σε ογκομετρική φιάλη των 1 000 ml και ο όγκος συμ-
πληρώνεται έως τη χαραγή. Λαμβάνονται ακριβώς 25 ml από το αποκτη-
θέν διάλυμα, μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml και αραιώ-
νονται, με συμπλήρωση του όγκου έως τη χαραγή, χρησιμοποιώντας το
ίδιο διάλυμα υδροξείδιου του καλίου.
Μετράται η απόσβεση του διαλύματος που αποκτήθηκε με τον τρόπο
αυτό στα 275 nm, χρησιμοποιώντας το διάλυμα υδροξείδιου του καλίου
ως αναφορά. Η μετρηθείσα απόσβεση χρησιμοποιώντας κυψελίδα του
1 cm πρέπει να είναι 0,2 ± 0,005.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 63
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ X «Α»
ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΔΙ' ΑΕΡΙΟΥ
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Το παρόν διεθνές πρότυπο παρέχει γενικές οδηγίες για την εφαρμογή της
αέριας χρωματογραφίας, με κοινές ►C1 (packed) ◄ ή τριχοειδείς
στήλες, στον προσδιορισμό της ποιοτικής και ποσοτικής σύστασης μείγ-
ματος μεθυλεστέρων, οι οποίοι λαμβάνονται από λιπαρά οξέα με τη
μέθοδο που καθορίζεται στο παράρτημα XB.
Η παρούσα μέθοδος δεν έχει εφαρμογή στα πολυμερισμένα λιπαρά οξέα.
2. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
2.1. Φέρον αέριο
Αδρανές αέριο (άζωτο, ήλιο, αργό, υδρογόνο, κ.λπ.) που έχει πλήρως
ξηρανθεί και περιέχει λιγότερο από 10 mg/kg οξυγόνου.
Σημείωση 1: Το υδρογόνο που χρησιμοποιείται ως φέρον αέριο μόνο με
τριχοειδείς στήλες, μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα διπλάσια
ταχύτητα ανάλυσης, αλλά είναι επικίνδυνο. Διατίθενται
συστήματα ασφαλείας.
2.2. Βοηθητικά αέρια
2.2.1. Υδρογόνο (καθαρότητας 99,9 %), απαλλαγμένο από οργανικές προσμεί-
ξεις.
2.2.2. Αέρας ή οξυγόνο χωρίς ►C1 οργανικές ◄ προσμείξεις.
2.3. Πρότυπο αναφοράς
Μείγμα μεθυλεστέρων ►C1 καθαρών ◄ λιπαρών οξέων ή μεθυλεστέ-
ρες λιπών γνωστής σύστασης, κατά προτίμηση ανάλογης με τη σύσταση
της προς ανάλυση λιπαρής ύλης.
Λαμβάνεται πρόνοια ώστε να παρεμποδιστεί η οξείδωση των πολυακό-
ρεστων λιπαρών οξέων.
3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ
Οι παρεχόμενες υποδείξεις αφορούν το συνήθη εργαστηριακό εξοπλισμό
αέριας χρωματογραφίας, με χρήση κοινών ή/και τριχοειδών στηλών και
ανιχνευτή ►C1 ιονιζούσης φλογός ◄. Οποιοσδήποτε εξοπλισμός, με
τον οποίο επιτυγχάνονται η αποδοτικότητα και η διακριτική ικανότητα
που καθορίζονται στο σημείο 4.1.2, είναι κατάλληλος.
3.1. Αέριος χρωματογράφος
Ο αέριος χρωματογράφος αποτελείται από τα παρακάτω ►C1 τμή-
ματα ◄:
3.1.1. Σ ύ σ τ η μ α έ γ χ υ σ η ς τ ο υ δ ε ί γ μ α τ ο ς
Χρησιμοποιείται σύστημα έγχυσης του δείγματος
α) είτε με κοινές στήλες, με το λιγότερο δυνατό μη ►C1 ωφέλιμο ◄
χώρο (στην περίπτωση αυτή, το σύστημα έγχυσης πρέπει να μπορεί
να θερμαίνεται σε θερμοκρασία 20 °C έως 50 °C υψηλότερη από τη
θερμοκρασία της στήλης)
β) είτε με τριχοειδείς στήλες, οπότε το σύστημα έγχυσης πρέπει να είναι
ειδικά σχεδιασμένο για χρήση με στήλες του είδους αυτού. Μπορεί
να είναι σύστημα με οπή (split) ή σύστημα έγχυσης πάνω στη στήλη
χωρίς οπή (splitless).
Σημείωση 2: Εφόσον δεν υπάρχουν στο δείγμα λιπαρά οξέα με λιγότερα
από 16 άτομα άνθρακα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί
σύστημα έγχυσης κινούμενης βελόνης.
3.1.2. Κ λ ί β α ν ο ς
Ο κλίβανος πρέπει να θερμαίνει τη στήλη σε θερμοκρασία τουλάχιστον
268 °C και να διατηρεί την επιθυμητή θερμοκρασία με ακρίβεια ± 1 °C,
προκειμένου για κοινές στήλες, ή ± 0,1 °C προκειμένου για τριχοειδείς.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 64
Η δεύτερη απαίτηση έχει ιδιαίτερη σημασία, όταν χρησιμοποιείται στήλη
από συντετηγμένο διοξείδιο του ►C1 πυριτίου ◄.
Η χρήση προγραμματισμού θερμοκρασίας για τη θέρμανση συνιστάται
σε όλες τις περιπτώσεις, αλλά ιδίως προκειμένου για λιπαρά οξέα με
λιγότερα από 16 άτομα άνθρακα.
3.1.3. Κ ο ι ν ή σ τ ή λ η ►C 1 ( p a c k e d c o l u m n ) ◄
3.1.3.1. Στήλη κατασκευασμένη από υλικό υδρανές σε σχέση με τις προς ανά-
λυση ουσίες (δηλαδή από γυαλί ή ανοξείδωτο χάλυβα) με τις ακόλουθες
διαστάσεις:
α) μήκος: 1 έως 3 μέτρα. Παρουσία λιπαρών οξέων με μακρά άλυσο
(άνω του C20), θα πρέπει να χρησιμοποιείται σχετικά κοντή στήλη.
Για την ανάλυση οξέων με 4 ή 6 άτομα άνθρακα, συνιστάται η χρήση
στήλης μήκους 2 μέτρων·
β) εσωτερική διάμετρος: 2 έως 4 mm.
Σημείωση 3: Με τις στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα είναι δυνατόν να
επέλθει αποσύνθεση των πολυακόρεστων συστατικών με
περισσότερους από τρεις διπλούς δεσμούς.
Σημείωση 4: Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σύστημα διπλών στηλών.
3.1.3.2. Υλικό πληρώσεως της στήλης, που αποτελείται από τα ακόλουθα στοι-
χεία:
α) υπόστρωμα: Γη διατόμων, που έχει υποβληθεί σε έκπλυση με οξύ και
σιλανοποίηση ή άλλο κατάλληλο αδρανές υπόστρωμα, με στενό
εύρος μεγέθους κόκκων (εύρος 25 μm μεταξύ των οριακών τιμών
125 μm και 200 μm)· το μέσο μέγεθος κόκκων εξαρτάται από την
εσωτερική διάμετρο και το μήκος της στήλης·
β) Στατική φάση: Πολική φάση πολυεστερικού τύπου (παραδείγματος
χάρη πολυηλεκτρική διαιθυλενογλυκόλη, πολυηλεκτρική βουτανο-
διόλη, ►C1 πολυαδιπική ◄ αιθυλενογλυκόλη κ.λπ.), κυανοσιλικό-
νες ή οποιαδήποτε άλλη φάση επιτρέπει τον απαιτούμενο διαχωρισμό
(βλέπει διάταξη 5). Η ►C1 στατική ◄ θα πρέπει να καταλαμβάνει
ποσοστό 5 % (m/m) έως 20 % (m/m) του υλικού πληρώσεως. Για
ορισμένους διαχωρισμούς μπορεί να χρησιμοποιηθεί μη πολική στα-
τική φάση.
3.1.3.3. Προετοιμασία (κοντισιονάρισμα)
Με τη στήλη αποσυνδεδεμένη, αν είναι δυνατόν, από τον ανιχνευτή, η
θερμοκρασία του κλιβάνου φέρεται σταδιακά στους 185 °C και, κατόπιν,
διοχετεύεται ρεύμα αδρανούς αερίου μέσω της πρόσφατα παρασκευα-
σμένης στήλης, με ταχύτητα ροής 20 ml/min έως 60 ml/min, για 16 ώρες
τουλάχιστον στην παραπάνω θερμοκρασία και για ακόμη 2 ώρες στους
195 °C.
3.1.4. Τ ρ ι χ ο ε ι δ ή ς σ τ ή λ η
3.1.4.1. Στήλη κατασκευασμένη από υλικό υδρανές σε σχέση με τις προς ανά-
λυση ουσίες (συνήθως γυαλί ή συντετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου). Η
εσωτερική διάμετρος κυμαίνεται μεταξύ 0,2 mm και 0,8 mm. Η εσωτε-
ρική επιφάνεια υποβάλλεται σε κατάλληλη κατεργασία (επιφανειακή
προετοιμασία, αδρανοποίηση), πριν επιστρωθεί με την στατική φάση.
Στις περισσότερες περιπτώσεις αρκεί μήκος 25 μέτρων.
3.1.4.2. Στατική φάση, συνήθως τύπου πολυγλυκόλης ►C1 (πολυαιθυλενογλυ-
κόλη) 20 000 ◄, πολυεστέρα (πολυηλεκτρική βουτανοδιόλη) ή πολικού
πολυσιλοξανίου (κυανοσιλικόνες). Κατάλληλες είναι οι στήλες με σταυ-
ροδεσμούς.
Σημείωση 4: Τα πολικά πολυσιλοξάνια υπάρχει κίνδυνος να προκαλέ-
σουν δυσχέρειες στην ταυτοποίηση και τον διαχωρισμό
του λινολενικού οξέος και των οξέων C20. Οι επιστρώσεις
πρέπει να είναι λεπτές, δηλαδή πάχους 0,1 μm έως
►C1 0,2μm ◄.
3.1.4.3. Συναρμολόγηση και προετοιμασία (κοντισιονάρισμα) της στήλης. Κατά
τη συναρμολόγηση των τριχοειδών στηλών τηρούνται οι συνήθεις προ-
φυλάξεις, δηλαδή διάταξη της στήλης στον κλίβανο (στήριγμα), επιλογή
και συναρμολόγηση των συνδέσμων (στεγανότητα), σύνδεση των άκρων
της στήλης μέ το σύστημα έγχυσης και τον ανιχνευτή (μείωση των μη
ωφελίμων χώρων). Η στήλη τοποθετείται κάτω από ρεύμα φέροντος
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 65
αερίου [παραδείγματος χάρη 0,3 bar (30 kPa), προκειμένου για στήλη
μήκους ►C1 25 m ◄ και εσωτερικής διαμέτρου 0,3 mm].
Το κοντισιονάρισμα της στήλης γίνεται με προγραμματισμό της θερμο-
κρασίας του κλιβάνου ώστε να ανέρχεται 3 °C/min από τη θερμοκρασία
περιβάλλοντος μέχρι μια θερμοκρασία 10 °C χαμηλότερη από το σημείο
αντοχής της στατικής φάσης. Η θερμοκρασία του κλιβάνου διατηρείται
στην τιμή αυτή για μία ώρα, μέχρι να σταθεροποιηθεί η γραμμή βάσεως,
έπειτα επαναφέρεται στους 180°C για εργασία σε ισόθερμες συνθήκες.
Σημείωση 5: Στο εμπόριο κυκλοφορούν κατάλληλα προετοιμασμένες
στήλες.
3.1.5. Ανιχνευτής, κατά προτίμηση επιδεχόμενος θέρμανση σε θερμοκρασία
υψηλότερη από της στήλης.
3.2. Σύριγγα
Η σύριγγα πρέπει να έχει ανώτατη χωρητικότητα 10 μl και να είναι
αριθμημένη ανά 0,1 μl.
3.3. Καταγραφέας
Αν για τον υπολογισμό της σύστασης του προς ανάλυση μείγματος
πρόκειται να χρησιμοποιηθεί καμπύλη καταγραφέα, απαιτείται ηλεκτρο-
νικός καταγραφέας μεγάλης ακρίβειας, συμβατός με τις χρησιμοποιού-
μενες συσκευές. Ο καταγραφέας πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτη-
ριστικά:
α) ταχύτητα απόκρισης μικρότερη από 1,5 s, κατά προτίμηση 1 s (ταχύ-
τητα απόκρισης είναι ο χρόνος που χρειάζεται η γραφίδα του κατα-
γραφέα για να καλύψει το διάστημα 8 % έως 90 % μετά την ακα-
ριαία είσοδο σήματος 100 %)·
β) πλάτος χαρτιού 20 cm κατ' ελάχιστο όριο·
γ) ταχύτητα χαρτιού ρυθμιζόμενη σε διάφορες τιμές μεταξύ
►C1 0,4 cm/min ◄ και 2,5 cm/min.
3.4. Ολοκληρωτής ή υπολογιστής (προαιρετικά)
Ταχείς και ακριβείς υπολογισμοί μπορούν να επιτευχθούν με τη βοήθεια
ηλεκτρονικού ολοκληρωτή ή ηλεκτρονικού υπολογιστή· το όργανο αυτό
πρέπει να παρέχει γραμμική απόκριση με επαρκή ευαισθησία, καθώς και
ικανοποιητική διόρθωση, όσον αφορά την απόκλιση της γραμμής
βάσεως.
4. ΕΚΤΕΛΕΣΗ
Οι εργασίες που περιγράφονται στα σημεία 4.1 έως 4.3 αφορούν τη
χρήση ανιχνευτή φλογός ιονισμού. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί,
εναλλακτικά, αέριος χρωματογράφος με ανιχνευτή θερμικής αγωγιμότη-
τος (καθαρόμετρο). Στην περίπτωση αυτή, οι συνθήκες της εργασίας
τροποποιούνται όπως περιγράφεται στη διάταξη 6.
4.1. Συνθήκες δοκιμής
4.1.1. Εκλογή των άριστων συνθηκών εργασίας
4.1.1.1. Κοινή στήλη
Για την εκλογή των συνθηκών δοκιμής, θα πρέπει να λαμβάνονται
υπόψη οι ακόλουθες μεταβλητές:
α) το μήκος και η διάμετρος της στήλης·
β) το είδος και η ποσότητα της στατικής φάσης·
γ) η θερμοκρασία της στήλης·
δ) η ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου·
ε) η απαιτούμενη διακριτική ικανότητα·
ζ) η ποσότητα του δείγματος δοκιμής, η οποία επιλέγεται με τρόπο
ώστε η συνδεσμολογία ανιχνευτή και ηλεκτρομέτρου να παρέχει
γραμμική απόκριση·
η) η διάρκεια της ανάλυσης.
Οι τιμές που παρατίθενται στους πίνακες 1 και 2 γενικά, οδηγούν στα
επιθυμητά αποτελέσματα, δηλαδή αποτελεσματικότητα τουλάχιστον
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 66
2 000 θεωρητικών πλακών ανά μέτρο μήκους της στήλης, για το στεα-
τικό μεθυλεστέρα και έκλουσή του σε 15 min περίπου.
Εφόσον το επιτρέπει ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός, η θερμοκρασία
του συστήματος έγχυσης θα πρέπει να είναι περίπου 200 °C και του
ανιχνευτή ίση ή υψηλότερη από τη θερμοκρασία της στήλης.
Κατά κανόνα, ο λόγος της ταχύτητας ροής του υδρογόνου, που διοχε-
τεύεται στον ανιχνευτή φλογός ιονισμού προς την ταχύτητα ροής του
φέροντος αερίου κυμαίνεται από 1:2 έως 1:1, ανάλογα με τη διάμετρο
της στήλης. Η ταχύτητα ροής του οξυγόνου είναι περίπου πενταπλάσια
έως δεκαπλάσια από του υδρογόνου.
Πίνακας 1
Εσωτερική διάμετρος στήλης
mm
Ταχύτητα ροής φέροντος αερίου
ml/min
2 15 έως 25
3 20 έως 40
4 40 έως 60
Πίνακας 2
►C1 Συγκέντρωση στατικής φάσης◄
% (m/m)
Θερμοκρασία στήλης
°C
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Τριχοειδής στήλη
Τα χαρακτηριστικά αποδοτικότητας και δυνατότητας των τριχοειδών
στηλών σημαίνουν ότι ο διαχωρισμός των συστατικών και η διάρκεια
της ανάλυσης εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την ταχύτητα ροής του
φέροντος αερίου στη στήλη. Κατά συνέπεια, για την επίτευξη άριστων
συνθηκών εργασίας, είναι απαραίτητο να ρυθμιστεί αυτή η παράμετρος
(ή, πιο απλά, το ύψος απωλειών της στήλης), ανάλογα με το αν επιδιώ-
κεται καλύτερος διαχωρισμός ή ταχύτερη ανάλυση.
4.1.2. Προσδιορισμός του αριθμού θεωρητικών πλακών (αποδοτικότητα) και
της διακριτικής ικανότητας (βλέπε σχήμα 1).
Εκτελείται ανάλυση μείγματος στεατικού μεθυλεστέρα και ελαϊκού
μεθυλεστέρα σε ίσες περίπου αναλογίες (παραδείγματος χάρη μεθυλε-
στέρες από βούτυρο κακάου).
Η θερμοκρασία της στήλης και η ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου
επιλέγονται με τρόπο ώστε το μέγιστο της κορυφής που αντιστοιχεί στο
στεατικό μευθλεστέρα να καταγράφεται 15 min περίπου μετά την
κορυφή που αντιστοιχεί στο διαλύτη. Χρησιμοποιείται αρκετή ποσότητα
από το μείγμα των μεθυλεστέρων, έστε η κορυφή που αντιστοιχεί στο
στεατικό μεθυλεστέρα να καταλαμβάνει περίπου τα 3/4 της πλήρους
κλίμακας.
Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών, n (αποδοτικότητα), υπολογίζεται με
τον τύπο:
n ¼ 16
drðIÞ
ωðIÞ
�2
ενώ η διακριτική ικανότητα, R με τον τύπο:
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 67
R ¼ 2 Δ
ωðIÞ þ ωðIIÞ
όπου:
dr(I) = είναι η απόσταση κατακράτησης, σε χιλιοστόμετρα,
από την αρχή του χρωματογραφήματος μέχρι το μέγι-
στο της κορυφής που αντιστοιχεί στο στεατικό μεθυλε-
στέρα,
ω(I) και ω(II) = είναι τα πλάτη, σε χιλιοστόμετρα, των κορυφών που
αντιπροσωπεύουν το στεατικό μεθυλεστέρα και τον
ελαϊκό μεθυλεστέρα, αντίστοιχα, τα οποία μετρώνται
μεταξύ των σημείων τομής των εφαπτομένων στα
σημεία καμπής των καμπυλών και της γραμμής
βάσεως,
Δ = είναι η απόσταση, σε χιλιοστόμετρα, μεταξύ των μεγί-
στων των κορυφών που αντιστοιχούν στο στεατικό
μεθυλεστέρα και στον ελαϊκό μεθυλεστέρα,
▼M2
και ο δείκτης διακριτικής ικανότητας με τον τύπο
Ir ¼ a
b
όπου:
a = είναι το ύψος της χαμηλότερης κορυφής, μετρούμενο ως προς τη
γραμμή βάσεως και
b = είναι το ύψος του χαμηλότερου σημείου της κοιλάδας της περι-
λαμβανόμενης μεταξύ των δύο προσκείμενων κορυφών, μετρού-
μενο ως προς τη γραμμή βάσεως.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 68
Σχήμα 1
Χρωματογράφημα για τον προσδιορισμό του αριθμού θεωσητικών πλακών (απο-
δοτικότητα) και της διαχωριστικής ικανότητας
Οι συνθήκες εργασίας που πρέπει να επιλέγονται είναι εκείνες με τις
οποίες επιτυγχάνονται αποδοτικότητα τουλάχιστον 2 000 θεωρητικών
πλακών ανά μέτρο μήκους της στήλης, για το στεατικό μεθυλεστέρα,
και διακριτική ικανότητα τουλάχιστον 1,25.
4.2. Δείγμα δοκιμής
Με τη βοήθεια της σύριγγας (3.2), λαμβάνονται 0,1 μl έως 2 μl από το
διάλυμα μεθυλεστέρων που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το παράρ-
τημα XB και ►C1 εγχύονται ◄ στη στήλη.
Σε περίπτωση που οι εστέρες δεν είναι διαλυμένοι, παρασκευάζεται
διάλυμα συγκεντρώσεως περίπου 100 mg/ml σε επτάνιο χρωματογραφι-
κής καθαρότητας, από το οποίο ►C1 εγχύονται ◄ 0,1 μl έως 1 μl.
Αν πρόκειται για ανάλυση συστατικών που περιέχονται μόνο σε ίχνη, η
ποσότητα του δείγματος δοκιμής μπορεί να αυξηθεί (έως 10 φορές).
4.3. Ανάλυση
Οι συνθήκες εργασίας είναι γενικά εκείνες που καθορίζονται στο σημείο
4.1.1.
Η εργασία, ωστόσο, μπορεί να εκτελεστεί σε χαμηλότερη θερμοκρασία
στήλης, όταν απαιτείται ο προσδιορισμός λιπαρών οξέων με λιγότερα
από 12 άτομα άνθρακα, ή σε υψηλότερη, προκειμένου για τον προσδιο-
ρισμό λιπαρών οξέων με περισσότερα από 20 άτομα άνθρακα. Όταν το
επιτρέπουν οι περιστάσεις, είναι δυνατόν να εφαρμοστεί προγραμματι-
σμός θερμοκρασίας και στις δύο παραπάνω περιπτώσεις. Παράδειγμα: αν
το δείγμα περιέχει τους μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων με λιγότερα από
12 άτομα άνθρακα, το δείγμα εγχέεται στους 100 °C (ή στους 50-60°C
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 69
παρουσία βουτυρικού οξέος) και αμέσως η θερμοκρασία φέρεται στην
►C1 μέγιστη τιμή ◄ με ταχύτητα 4 °C/min έως 8 °C/min. Σε ορισμέ-
νες περιπτώσεις, μπορεί να γίνει συνδυασμός των δύο τεχνικών.
Μετά τη θέρμανση με προγραμματισμό θερμοκρασίας, συνεχίζεται η
έκλουση σε σταθερή θερμοκρασία, μέχρι να εκλουσθούν όλα τα συστα-
τικά. Εάν το όργανο δεν επιτρέπει θέρμανση με προγραμματισμό θερμο-
κρασίας, η εργασία εκτελείται σε δύο καθορισμένες θερμοκρασίες
μεταξύ 180 °C και 195 °C.
Συνιστάται, εφόσον είναι απαραίτητο, η διεξαγωγή δύο αναλύσεων με
στατικές φάσεις διαφορετικής πολικότητας, ώστε να επιβεβαιωθεί η
απουσία συγκαλυμμένων κορυφών, παραδείγματος χάρη στην περίπτωση
της ταυτόχρονης παρουσίας συζυγών C18:3 και ►C1 C20: 0 ◄ ή C18:3
και C18:2.
4.4. Καταγραφή του χρωματογραφήματος και των γραφικών παραστά-
σεων αναφοράς
Εκτελείται ανάλυση του πρότυπου μείγματος αναφοράς (2.3), με τις ίδιες
συνθήκες εργασίας όπως για το δείγμα, και μετρώνται οι χρόνοι ή οι
αποστάσεις κατακράτησης για τα λιπαρά οξέα που το αποτελούν. Για
κάθε βαθμό ακορέστου, σχεδιάζονται σε ημιλογαριθμικό χαρτί οι γραφι-
κές παραστάσεις που απεικονίζουν το λογάριθμο του χρόνου ή της από-
στασης κατακράτησης συναρτήσει του αριθμού ατόμων άνθρακα. Σε
ισόθερμες συνθήκες, οι καμπύλες για οξέα με ευθεία άλυσο και τον
ίδιο βαθμό ακορέστου θα πρέπει να είναι ευθείες γραμμές, σχεδόν
παράλληλες.
Είναι απαραίτητο να αποφεύγονται οι συνθήκες εκείνες, που επιτρέπουν
«συγκαλυμμένες κορυφές», δηλαδή με τις οποίες η διακριτική ικανότητα
είναι ανεπαρκής για το διαχωρισμό δύο συστατικών.
5. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
5.1. Ποιοτική ανάλυση
Οι κορυφές που αντιστοιχούν στους μεθυλεστέρες του δείγματος ταυτο-
ποιούνται από τις καμπύλες του σημείου 4.4, αν είναι απαραίτητο με
παρεμβολή.
5.2. Ποσοτική ανάλυση
5.2.1. Π ρ ο σ δ ι ο ρ ι σ μ ό ς τ η ς σ ύ σ τ α σ η ς
Εκτός από εξαιρετικές περιπτώσεις, εφαρμόζεται η μέθοδος εσωτερικής
κανονικοποίησης, δηλαδή λαμβάνεται ως δεδομένο ότι στο χρωματογρά-
φημα εμφανίζεται το σύνολο των συστατικών του δείγματος, με τρόπο
ώστε το συνολικό εμβαδόν που περικλείεται από τις κορυφές να αντι-
προσωπεύει το 100 % των συστατικών (πλήρης έκλουση).
Εάν ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός περιλαμβάνει ολοκληρωτή, χρησι-
μοποιούνται οι αριθμοί που λαμβάνονται από αυτόν. Σε αντίθετη περί-
πτωση, το εμβαδόν που περικλείεται από κάθε κορυφή προσδιορίζεται
πολλαπλασιάζοντας το ύψος της επί το πλάτος της στο μέσον του ύψους,
ενώ λαμβάνονται υπόψη, κατά περίπτωση, οι διάφορες εξασθενήσεις του
σήματος κατά την καταγραφή.
5.2.2. Τ ρ ό π ο ς υ π ο λ ο γ ι σ μ ο ύ
5.2.2.1. Γενική περίπτωση
Η περιεκτικότητα σε δεομένο συστατικό i, εκφραζόμενη σε κατά μάζα
εκατοστιαία αναλογία μεθυλεστέρων, υπολογίζεται με τον προσδιορισμό
του επί τοις εκατό ποσοστού που αντιπροσωπεύει το εμβαδόν της αντί-
στοιχης κορυφής ως προς το άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυ-
φών, εφαρμόζοντας τον τύπο:
▼C1
AI
ΣΑ
� 100
▼B
όπου:
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 70
AI = είναι το εμβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η
οποία αντιστοιχεί στο συστατικό i,
►C1 ΣΑ ◄= είναι το άθροισμα των εμβαδών που περικλείονται από
όλες τις κορυφές.
Το αποτέλεσμα δίδεται με ένα δεκαδικό φηφίο.
Σημείωση 6: Στη γενική αυτή περίπτωση, θεωρείται ότι το αποτέλεσμα
του υπολογισμού βάσει των σχετικών εμβαδών αντιπροσω-
πεύει εκατοστιαία αναλογία κατά μάζα. Για τις περιπτώ-
σεις όπου η υπόθεση αυτή δεν ευσταθεί, βλέιπε σημείο
5.2.2.2.
5.2.2.2. Χρήση συντελεστών διορθώσεως
Σε ορισμένες περιπτώσεις, παραδείγματος χάρη παρουσία λιπαρών
οξέων με λιγότερα από 8 άτομα άνθρακα ή οξέων με δευτερεύουσες
ομάδες, όταν χρησιμοποιούνται ανιχνευτές θερμικής αγωγιμότητας ή
όταν απαιτείται οπωσδήποτε η μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια, θα πρέπει
να χρησιμοποιούνται συντελεστές διορθώσεως για τη μετατροπή του επί
τοις εκατό ποσοστού των εμβαδών των κορυφών σε κατά μάζα εκατο-
στιαίες αναλογίες συστατικών.
Οι συντελεστές διορθώσεως καθορίζονται με τη βοήθεια χρωματογρα-
φήματος που προκύπτει από την ανάλυση μείγματος μεθυλεστέρων γνω-
στής σύστασης η οποία εκτελείται με πανομοιότυπες συνθήκες εργασίας
όπως η ανάλυση του δείγματος.
Για το εν λόγω μείγμα αναφοράς, η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία
του συστατικού i παρέχεται από τον τύπο:
miP
m
� 100
όπου
mi = είναι η μάζα του συστατικού i στο μείγμα αναφοράς,
∑m = είναι η συνολική μάζα των διαφόρων συστατικών του μείγματος
αναφοράς.
Από το χρωματογράφημα του μείγματος αναφοράς (4.4), υπολογίζεται το
επί τοις εκατό ποσοστό (εμβαδόν/εμβαδόν) για το συστατικό i ως εξής:
AiP
Α
� 100
όπου
Ai = είναι το εμβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η οποία
αντιστοιχεί στο συστατικό i,
∑A = είναι το άθροισμα των εμβαδών που περικλείονται από όλες τις
κορυφές.
Ο συντελεστής διορθώσεων υπολογίζεται τότε ος λόγος
Ki ¼ mi �
P
A
Ai �
P
m
Στην κοινή πρακτική, οι συντελεστές διορθώσεως εκφράζονται σε σχέση
με το συντελεστή KC16 οπότε προκύπτουν οι σχετικοί συντελεστές
K′i ¼ KiKC16
Όσον αφορά το δείγμα, η περιεκτικότητα σε κάθε συστατικό i εκφρα-
ζόμενη ως κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία μεθυλεστέρων, είναι
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 71
K′i � AiP ðK′i � AiÞ � 100
Τα αποτελέσματα δίδονται με ένα δεκαδικό ψηφίο.
5.2.2.3. Χρήση εσωτερικού προτύπου
Σε ορισμένες αναλύσεις (παραδείγματος χάρη όταν ο ποσοτικός προ-
σδιορισμός δεν αφορά όλα τα λιπαρά οξέα, όπως στην περίπτωση ταυ-
τόχρονης παρουσίας οξέων με 4 και 6 ατομα άνθρακα και οξέων με 16
και 18 άτομα άνθρακα, ή όταν είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί η
απόλυτη ποσότητα ενός λιπαρού οξέος σε ένα δείγμα) απαιτείται η
χρήση εσωτερικού προτύπου. Χρησιμοποιούνται συνήθως λιπαρά οξέα
με 5, 15 ή 17 άτομα άνθρακα. Ο συντελεστής διορθώσεως (αν έχει
εφαρμογή) θα πρέπει να προσδιορίζεται και για το εσωτερικό πρότυπο.
Η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία του συστατικού i, εκφραζόμενη σε
μεθυλεστέρες, παρέχεται από τον τύπο:
ms � K′i � Ai
m � K′s � As � 100
όπου
Ai = είναι το εμβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η οποία
αντιστοιχεί στο συστατικό i,
As = είναι το εμβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η οποία
αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο,
K′i = είναι ο συντελεστής διορθώσευς για το συσταρικό i (σχετικός,
ως προς τον KC16),
K′s = είναι ο συντελεστής διορθώσεως για το εσωτερικό πρότυπο
(σχετικός, ως προς τον KC16),
m = είναι η μάζα του δείγματος δοκιμής, σε χιλιοστόγραμμα,
ms = είναι η μάζα του εσωτερικού προτύπου, σε χιλιοστόγραμμα.
Τα αποτελέσματα δίδονται με ένα δεκαδικό ψηφίο.
▼M2
6. ΕΙΔΙΚΗ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ TRANS ΙΣΟΜΕΡΩΝ
Είναι δυνατό να προσδιορισθεί η περιεκτικότητα σε trans ισομερή των
λιπαρών οξέων με αριθμό ατόμων άνθρακος μεταξύ 10 και 24, με δια-
χωρισμό των μεθυλεστέρων και με χρήση τροχοειδών στηλών χρωματο-
γραφίας οι οποίες έχουν συγκεκριμένη πολικότητα.
6.1. Τριχοειδής στήλη από οξείδιο του πυριτίου, εσωτερικής διαμέτρου από
0,25 έως 0,32 mm και μήκους 50 m, με επίχρισμα κυανοπροπυλσιλικό-
νης πάχους μεταξύ 0,1 και 0,3 μm (τύπου SP 2340, τύπου SP 2380,
C.P.sil 88, Silor 10 και άλλων παρομοίων).
▼M21
6.2. Οι μεθυλεστέρες παρασκευάζονται σύμφωνα με τη μέθοδο Β του παραρ-
τήματος Χ«Β». Οι λιπαρές ουσίες των οποίων η περιεκτικότητα σε
ελεύθερα οξέα υπερβαίνει το 3 % πρέπει να εξουδετερώνονται προηγου-
μένως σύμφωνα με το σημείο 5.1.1 του παραρτήματος VII.
▼M2
6.3. Οι συνθήκες εργασίας για τη χρωματογραφία αέρος φάσεως είναι συν-
ολικά οι ακόλουθες:
— η θερμοκρασία της στήλης ρυθμίζεται στους 150° C έως 230° C (π.χ.
165° C επί 15 λεπτά και εν συνεχεία αυξάνεται κατά 5° C ανά λεπτό
μέχρι τη θερμοκρασία των 200° C),
— θερμοκρασία της διάταξης εγχύσεως: 250° C όταν χρησιμοποιείται
το σύστημα split ή η αρχική θερμοκρασία της στήλης όταν χρησι-
μοποιείται το σύστημα εγχύσεως πάνω στη στήλη (on column),
— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 260 ° C,
— παροχή του φέροντος αερίου (ήλιο και υδρογόνο): 1,2 ml ανά λεπτό.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 72
Η εισαγόμενη ποσότητα πρέπει να είναι τέτοια ώστε στις χρησιμοποιού-
μενες συνθήκες ευαισθησίας το ύψος της κορυφής που αντιστοιχεί στο
μεθυλεστέρα του αραχιδικού οξέος να είναι ίσο ή να υπερβαίνει το 20 %
του κάτω μέρος της κλίμακας.
6.4. Η αναγνώριση των διαφόρων μεθυλεστέρων γίνεται επί τη βάσει των
χρόνων συγκρατήσεως οι οποίοι συγκρίνονται προς εκείνους των μειγ-
μάτων αναφοράς. (Όπως αναφέρεται στο σημείο 2.3).
Οι εστέρες των λιπαρών οξέων trans εκλύονται πριν από τα αντίστοιχα
ισομερή cis. Το σχήμα 2 εμφαίνει σχετικό χρωματογράφημα.
Σχήμα 2
Χρωματογράφημα για τον προσδιορισμό των ισομερών trans των λιπαρών οξέων
με τριχοειδή στήλη
6.5. Η αποδοτικότητα της στήλης, η προσδιοριζόμενη σύμφωνα με το σημείο
4.1.2, πρέπει να επιτρέπει διαχωρισμό ορισμένων κρίσιμων ζευγών, για
παράδειγμα το ζεύγος που σχηματίζεται από τη ζώνη των trans ισομερών
του ισοελαϊκού οξέος και την κορυφή του ελαϊκού οξέος, trans C 18:
1/cis C 18: 1, με δείκτη διακριτικής ικανότητας ανώτερο του 2,
6.6. Το ποσοστό των διαφόρων οξέων trans υπολογίζεται με τη βοήθεια της
σχέσεως ανάμεσα στο εμβαδόν της αντίστοιχης κορυφής και το άθροι-
σμα των εμβαδών όλων των κορυφών.
Λαμβάνονται υπόψη τα ποσοστά των οξέων:
— trans δεκαοκτανικών (T 18:1) που αναφέρονται στο παράρτημα του
παρόντος κανονισμού ως σύνολο των trans ισομερών ελαϊκού οξέος,
— cis-trans και trans-cis δεκαοκταδιενικών [(CT/TC) 8:2] που αναφέρο-
νται στο παράρτημα του παρόντος κανονισμού ως σύνολο των trans
ισομερών λινελαϊκού οξέος,
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, δεκαοκτατριε-
νικών [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], που αναφέρονται στο
παράρτημα του παρόντος κανονισμού ως σύνολο των trans ισομερών
λινολενικού οξέος.
▼M2
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 73
Σημείωση 8: Λαμβανομένων υπόψη των ιδιαιτέρων χαρακτηριστικών
αυτής της μεθόδου, τα αποτελέσματα να δίδονται με δύο
δεκαδικούς.
▼B
7. ΕΙΔΙΚΗ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ — ΧΡΗΣΗ ΚΑΘΑΡΟΜΕΤΡΟΥ ΩΣ ΑΝΙ-
ΧΝΕΥΤΗ (ΠΟΥ ΛΕΙΤΟΥΡΓΕΙ ΒΑΣΕΙ ΤΗΣ ΑΡΧΗΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟ-
ΛΩΝ ΤΗΣ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΑΓΩΓΙΜΟΤΗΤΑΣ)
Για τον προσδιορισμό της ποιοτικής και ποσοτικής σύστασης μείγματος
μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί αέριος
χρωματογράφος με ανιχνευτή που λειτουργεί βάσει της αρχής των μετα-
βολών της θερμικής αγωγιμότητας (καθαρόμετρο). Στην περίπτωση
αυτή, οι συνθήκες που καθορίζονται στις διατάξεις 3 και 4 θα πρέπει
να τροποποιούνται όπως φαίνεται στον πίνακα 3.
Για την ποσοτική ανάλυση χρησιμοποιούνται οι συντελεστές διορθώ-
σεως που ορίζονται στο σημείο 5.2.2.2.
Πίνακας 3
Μεταβλητή Τιμή/συνθήκη
Στήλη Μήκος: 2 έως 4 μέτρα
Εσωτερική διάμετρος: 4 mm
Υπόστρωμα Μέγεθος κόκκων από 160 μm έως
200 μm
Συγκέντρωση ακίνητης φάσης 15 % (m/m) έως 25 % (m/m)
Φέρον αέριο Ήλιο ή, ελλείψει αυτού, υδρογόνο,
με τη χαμηλότερη δυνατή περιε-
κτικότητα σε οξυγόνο
Βοηθητικά Κανένα
Θερμοκρασία συστήματος έγχυσης 40—60 °C υψηλότερη από της
στήλης
Θερμοκρασία στήλης Μεταξύ 180 °C και 200 °C
Ταχύτητα ροής φέροντος αερίου Συνήθως μεταξύ 60 ml/min και
80 ml/min
Με ποσότητα του εγχεόμενου δείγ-
ματος δοκιμής
Συνήθως μεταξύ 0,5 μl και 2 μl
8. ►C1 ΕΚΘΕΣΗ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ◄
►C1 Στην έκθεση ανάλυσης περιγράφονται ◄ οι μέθοδοι που χρησι-
μοποιήθηκαν για παρασκευή των μεθυλεστέρων και για την αεριοχρω-
ματογραφική ανάλυσή τους, καθώς και τα αποτελέσματα που προέκυ-
ψαν. Αναφέρονται επίσης όλες οι λεπτομέρειες των εργασιών, που δεν
καθορίζονται στο παρόν διεθνές πρότυπο ή θεωρούνται προαιρετικές,
καθώς και των τυχόν συμβάντων, που ενδέεται να έχουν επηρεάσει τα
αποτελέσματα.
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει όλα τα απαραίτητα στοιχεία
για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγματος.
▼M2
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 74
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ X «B»
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ
ΚΑΙ ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ
Για την παρασκευή των μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων ελαιολάδου και πυρηνε-
λαίων συνιστώνται οι ακόλουθες δύο μέθοδοι:
Μέθοδος A: Μετεστεροποίηση εν ψυχρώ μέσω μεθανολικού διαλύματος υδρο-
ξειδίου του καλίου
Μέθοδος B: Μεθυλίωση εν θερμώ μέσω μεθανολικού διαλύματος μεθυλικού
νατρίου ακολουθούμενη από εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον.
Η επιλογή της μίας ή της άλλης μεθόδου εξαρτάται από την προς προσδιορισμό
αναλυτική παράμετρο και από την κατηγορία του ελαίου, όπως υποδεικνύεται
παρακάτω:
α) προσδιορισμός της διαφοράς μεταξύ πραγματικής και θεωρητικής περιεκτικό-
τητας σε τριγλυκερίδια με την ECN42 (ΔΕCN42):
— η μέθοδος A εφαρμόζεται σε δείγματα ελαίων όλων των κατηγοριών
ύστερα από καθαρισμό του ελαίου μέσω διέλευσής του από στήλη διο-
ξειδίου του πυριτίου:
β) προσδιορισμός της συστάσεως σε λιπαρά οξέα:
— η μέθοδος A εφαρμόζεται απευθείας σε δείγματα ελαίων των κατωτέρω
κατηγοριών:
— παρθένο ελαιόλαδο με ελεύθερη οξύτητα κάτω του 3,3 %,
— εξευγενισμένο παρθένο ελαιόλαδο,
— ελαιόλαδο (μείγμα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισμένου παρθέ-
νου ελαιολάδου),
— εξευγενισμένο πυρηνέλαιο,
— πυρηνέλαιο (μείγμα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισμένου πυρη-
νελαίου),
— η μέθοδος Β εφαρμόζεται απευθείας σε δείγματα ελαίων των κατωτέρω
κατηγοριών:
— παρθένο ελαιόλαδο με ελεύθερη οξύτητα άνω του 3,3 %,
— ακατέργαστο πυρηνέλαιο,
γ) προσδιορισμός των trans ισομερών λιπαρών οξέων:
— η μέθοδος A εφαρμόζεται απευθείας σε δείγματα ελαίων των κατωτέρω
κατηγοριών:
— παρθένο ελαιόλαδο με ελεύθερη οξύτητα κάτω του 3,3 %,
— εξευγενισμένο παρθένο ελαιόλαδο,
— ελαιόλαδο (μείγμα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισμένου παρθέ-
νου ελαιολάδου),
— εξευγενισμένο πυρηνέλαιο,
— πυρηνέλαιο (μείγμα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισμένου πυρη-
νελαίου),
— η μέθοδος A εφαρμόζεται απευθείας σε δείγματα ελαίων των κατωτέρω
κατηγοριών ύστερα από καθαρισμό του ελαίου μέσω διέλευσής του από
στήλη διοξειδίου του πυριτίου:
— παρθένο ελαιόλαδο με ελεύθερη οξύτητα άνω του 3,3 %,
— ακατέργαστο πυρηνέλαιο.
ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΕΛΑΙΟΥ
Εφόσον είναι αναγκαίο, τα δείγματα καθαρίζονται διοχετεύοντας το έλαιο από
στήλη διοξειδίου του πυριτίου, χρησιμοποιώντας ως διαλύτη έκλουσης εξάνιο/-
διαιθυλαιθέρα (87:13, v/v), όπως περιγράφεται στη μέθοδο IUPAC 2.507.
Ως εναλλακτική μέθοδος, είναι δυνατή η προσφυγή σε εκχύλιση σε στερεά φάση
χρησιμοποιώντας φύσιγγες διοξειδίου του πυριτίου. Φύσιγγα διοξειδίου του πυρι-
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 75
τίου (1 g, 6 ml) τοποθετείται σε συσκευή εκλούσεως υπό κενό και πλένεται με
6 ml εξανίου. Η εφαρμογή κενού διακόπτεται για να αποφευχθεί ξήρανση της
στήλης. Στη συνέχεια, εισάγεται στη στήλη διάλυμα ελαίου (περίπου 0,12 g) σε
0,5 ml εξανίου και εφαρμόζεται κενό για εισαγωγή του διαλύματος στο διοξείδιο
του πυριτίου και στη συνέχει γίνεται έκλουση με 10 ml εξανίου/διαιθυλαιθέρα
(87:13 v/v) υπό κενό. Το σύνολο των εκλουσμάτων ομοιογενοποιείται και χωρί-
ζεται σε δύο ίσα μέρη. Το ένα εκ των δύο μερών εξατμίζεται μέχρι ξηράνσεως
σε περιστροφικό εξατμιστήρα υπό ελαττωμένη πίεση και σε θερμοκρασία περι-
βάλλοντος. Το υπόλειμμα διαλύεται σε 1 ml επτανίου. Το λαμβανόμενο διάλυμα
είναι έτοιμο για την ανάλυση των λιπαρών οξέων με CPG. Το δεύτερο μέρος
εξατμίζεται και το υπόλειμμα διαλύεται σε 1 ml ακετόνης για ανάλυση των
τριγλυκεριδίων, με HPCL εφόσον χρειάζεται.
ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ
1. Μέθοδος A: Μετεστεροποίηση εν ψυχρώ με μεθανολικό διάλυμα υδρο-
ξειδίου του καλίου
1.1. Εφαρμογή
Η ταχεία αυτή μέθοδος εφαρμόζεται σε ελαιόλαδα και πυρηνέλαια με
περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα κάτω του 3,3 %. Τα ελεύθερα
λιπαρά οξέα δεν εστεροποιούνται με υδροξείδιο του καλίου. Οι αιθυλε-
στέρες των λιπαρών οξέων μετεστεροποιούνται βραδύτερα από τους
γλυκεριδικούς εστέρες, ενώ είναι δυνατόν να μετεστεροποιηθούν μόνον
μερικώς.
1.2. Αρχή
Οι μεθυλεστέρες σχηματίζονται με μετεστεροποίηση σε μεθανολικό διά-
λυμα υδροξειδίου του καλίου ως ενδιάμεση φάση πριν από τη σαπωνο-
ποίηση (σημείο 5 της μεθόδου ISO 5509:2000, σημείο 5 της μεθόδου
IUPAC 2.301).
1.3. Αντιδραστήρια
Μεθανόλη με περιεκτικότητα σε νερό όχι άνω του 0,5 % (m/m).
Επτάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας.
Υδροξείδιο του καλίου, μεθανολικό διάλυμα περίπου 2 N: διαλύουμε
11,2 g υδροξειδίου του καλίου σε 100 ml μεθανόλης.
1.4. Εξοπλισμός
Δοκιμαστικοί σωλήνες με βιδωτό πώμα (χωρητικότητας 5 ml) εφοδια-
σμένο με παρέμβυσμα από PTFE.
Βαθμονομημένα ή αυτόματα σιφώνια των 2 και 0,2 ml.
1.5. Τρόπος εργασίας
Σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό πώμα των 5 ml, ζυγίζονται περίπου
0,1 g δείγματος ελαίου. Προστίθενται 2 ml επτανίου και αναδεύονται.
Προστίθενται 0,2 ml μεθανολικού διαλύματος 2 N υδροξειδίου του
καλίου, ο σωλήνας πωματίζεται με το εφοδιασμένο με παρέμβυσμα
από PTFE πώμα και το όλον αναδεύεται ισχυρά επί 30 δευτερόλεπτα.
Ο σωλήνας αφήνεται σε ηρεμία μέχρις ότου το πάνω μέρος του διαλύ-
ματος να καταστεί διαυγές. Η άνω στιβάδα, η οποία και περιέχει τους
μεθυλεστέρες, μεταγγίζεται. Το διάλυμα επτανίου είναι έτοιμο για
έγχυση στο χρωματογράφο. Συνιστάται το διάλυμα να διατηρείται σε
ψυγείο μέχρι τη στιγμή της χρωματογραφικής ανάλυσης και να αποφεύ-
γεται η αποθήκευσή του επί χρονικό διάστημα άνω των δώδεκα ωρών.
2. Μέθοδος B: Μεθυλίωση εν θερμώ με μεθανολικό διάλυμα μεθυλικού
νατρίου ακολουθούμενη από εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον
2.1. Εφαρμογή
Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται σε ελαιόλαδα και πυρηνέλαια με περιεκτι-
κότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα άνω του 3,3 %.
2.2. Αρχή
Εξουδετέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων και επίδραση αλκαλικού
μεθανολικού διαλύματος στα γλυκερίδια, ακολουθούμενη από εστερο-
ποίηση των λιπαρών οξέων σε όξινο περιβάλλον (σημείο 4.2 της μεθό-
δου IUPAC 2.301).
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 76
2.3. Αντιδραστήρια
— επτάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας,
— μεθανόλη με περιεκτικότητα σε νερό όχι άνω του 0,5 % (m/m),
— μεθυλικό νάτριο, μεθανολικό διάλυμα 0,2 N: 5 g νατρίου διαλύονται
σε 1 000 ml μεθανόλης (μπορεί να παρασκευαστεί από διαλύματα
του εμπορίου),
— φαινολοφθαλεΐνη, 0,2 % μεθανολικό διάλυμα,
— θειικό οξύ, σε μεθανολικό διάλυμα 1 N: 3 ml θειικού οξέος 96 %
προστίθενται σε 100 ml μεθανόλης,
— κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου νατρίου σε νερό.
2.4. Εξοπλισμός
— ογκομετρική φιάλη χωρητικότητας 50 ml, με επίπεδο πυθμένα και
μακρύ και στενό εσμυρισμένο λαιμό,
— κάθετος ψυκτήρας: αεροψυκτήρας (μήκους 1 m) με εσμυρισμένη
άρθρωση,
— ρυθμιστής βρασμού,
— γυάλινο χωνί.
2.5. Τρόπος εργασίας
0,25 g δείγματος ελαίου προστίθενται σε ογκομετρική φιάλη με εσμυρι-
σμένο λαιμό των 50 ml. Με τη βοήθεια του χωνιού, προστίθενται 10 ml
του μεθανολικού διαλύματος 0,2 N μεθυλικού νατρίου και ο ρυθμιστής
βρασμού. Το διάλυμα, έπειτα από δέκα λεπτά, πρέπει να γίνει διαυγές. Η
αντίδραση τερματίζεται πρακτικά μετά δεκαπέντε λεπτά. Η φιάλη απο-
σύρεται από την πηγή θερμότητας, αναμένεται να σταματήσει η αναρ-
ροή, ο ψυκτήρας αποσύρεται και προστίθενται δύο σταγόνες διαλύματος
φαινολοφθαλεΐνης. Στο μεθανολικό διάλυμα προστίθενται μερικά ml
θειικού οξέος 1 N μέχρις ότου να καταστεί άχρουν και κατόπιν προστί-
θεται επιπλέον 1 ml ακόμη. Προσαρμόζεται ο ψυκτήρας και το διάλυμα
φέρεται εκ νέου σε βρασμό επί είκοσι λεπτά περίπου. Η φιάλη αποσύ-
ρεται από την πηγή θερμότητας και επαναψύχεται σε ρεύμα ύδατος. Ο
ψυκτήρας απομακρύνεται, προστίθενται 20 ml του κορεσμένου διαλύμα-
τος χλωριούχου νατρίου και το διάλυμα αναδεύεται. Προστίθενται 5 ml
επτανίου, η φιάλη πωματίζεται και ανακινείται ζωηρά επί δεκαπέντε
δευτερόλεπτα.
Αφήνεται να κατακαθίσει μέχρι πλήρους διαχωρισμού των δύο φάσεων.
Προστίθεται εκ νέου μέρος του κορεσμένου διαλύματος χλωριούχου
νατρίου μέχρις ότου η υδατική φάση φθάσει το κάτω μέρος του λαιμού
της φιάλης. Τους μεθυλεστέρες περιέχει η πάνω στιβάδα που βρίσκεται
στο λαιμό της φιάλης. Το λαμβανόμενο διάλυμα είναι έτοιμο για έγχυση
στον αεριοχρωματογράφο.
Προσοχή: Η μεθυλίωση με τη μέθοδο Β πρέπει να γίνεται σε απαγωγό.
2.6. Εναλλακτικοί αντί της μεθυλίωσης τρόποι σύμφωνα με τη μέθοδο Β
2.6.1. Μέθοδος Γ
2.6.1.1. Αρχή
Η προς ανάλυση λιπαρή ύλη υποβάλλεται σε κατεργασία με μεθανολικό
διάλυμα υδροχλωρικού οξέος σε κλειστό φιαλίδιο, στους 100 °C.
2.6.1.2. Εξοπλισμός
— Γυάλινο παχύτοιχο φιαλίδιο χωρητικότητας περίπου 5 ml (ύψος 40
έως 45 mm, διάμετρος 14 έως 16 mm).
— Βαθμονομημένα σιφώνια του 1 και 2 ml.
2.6.1.3. Αντιδραστήρια
Διάλυμα υδροχλωρικού οξέος σε 2 % μεθανόλη, παρασκευαζόμενο από
αέριο υδροχλώριο και άνυδρη μεθανόλη (σημείωση 1).
Εξάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 77
Σημείωση 1: Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διαλύματα υδροχλω-
ρίου σε μεθανόλη του εμπορίου. Στο εργαστήριο, είναι
εύκολο να παρασκευαστούν μικρές ποσότητες αερίου
υδροχλωρίου τροποποιώντας το διάλυμα του εμπορίου
(P = 1,18), με προσθήκη μερικών σταγονών πυκνού θειι-
κού οξέος. Επειδή η μεθανόλη απορροφά ισχυρώς το
αέριο υδροχλώριο, σκόπιμο είναι να λαμβάνονται όλες οι
δυνατές προφυλάξεις χρήσεως κατά τη διάλυση (π.χ. εισ-
αγωγή του αερίου με τη βοήθεια μικρού ανεστραμμένου
χωνιού που μόλις εγγίζει την επιφάνεια της μεθανόλης).
Είναι δυνατόν να παρασκευαστούν εκ των προτέρων
σημαντικές ποσότητες μεθανολικών διαλυμάτων υδροχλω-
ρικού οξέος που διατηρούνται απόλυτα στο σκότος μέσα
σε φιάλες εφοδιασμένες με γυάλινο πώμα. Το αντιδραστή-
ριο αυτό μπορεί επίσης να παρασκευαστεί διαλύοντας ακε-
τυλοχλωρίδιο σε άνυδρη μεθανόλη.
2.6.1.4. Τρόπος λειτουργίας
— Στο γυάλινο φιαλίδιο προστίθενται 0,2 g λιπαρής ύλης που έχει
προηγουμένως ξηρανθεί με θειικό νάτριο και διηθηθεί, και κατόπιν
προστίθενται 2 ml του μεθανολικού διαλύματος υδροχλωρικού οξέος.
Το φιαλίδιο κλείνεται.
— Το φιαλίδιο βυθίζεται σε λουτρό στους 100 °C επί 40 λεπτά.
— Το φιαλίδιο ψύχεται σε ρεύμα ύδατος, το ανοίγουμε και προστίθενται
2 ml απεσταγμένου νερού και 1 ml εξανίου.
— Φυγοκεντρούμε και η εξανική φάση απομακρύνεται, έτοιμη προς
χρήση.
2.6.2. Μέθοδος Δ
2.6.2.1. Αρχή
Η προς ανάλυση λιπαρή ύλη θερμαίνεται υπό αναρροή με μεθανόλη,
εξάνιο και θειικό οξύ. Οι λαμβανόμενοι ούτως μεθυλεστέρες εκχυλίζο-
νται με πετρελαϊκό αιθέρα.
2.6.2.2. Εξοπλισμός
— Δοκιμαστικός σωλήνας χωρητικότητας περίπου 20 ml με κάθετο
αεροψυκτήρα μήκους περίπου 1 m, εφοδιασμένο με εσμυρισμένη
άρθρωση.
— Βαθμονομημένο σιφώνιο 5 ml.
— Διαχωριστική χοάνη 50 ml.
— Ογκομετρικοί κύλινδροι των 10 και 25 ml.
— Δοκιμαστικός σωλήνας με κωνικό πυθμένα των 15 ml.
2.6.2.3. Αντιδραστήρια
— Αντιδραστήριο μεθυλίωσης: άνυδρη μεθανόλη, εξάνιο και πυκνό
θειικό οξύ (p = 1,84 στην ακόλουθη αναλογία: 75:25:1 (V/V/V).
— Πετρελαϊκός αιθέρας 40 έως 60 °C.
— Άνυδρο θειικό νάτριο.
2.6.2.4. Τρόπος εργασίας
Στο σωλήνα των 20 ml εισάγονται 0,1 g ελαίου και προστίθενται 5 ml
από το αντιδραστήριο μεθυλίωσης.
Συνδέεται ο ψυκτήρας και θερμαίνουμε σε υδρόλουτρο μέχρι βρασμού
επί 30 λεπτά (σημείωση 2).
Το μείγμα μεταφέρεται ποσοτικά σε διαχωριστική χοάνη 50 ml με 10 ml
απεσταγμένου ύδατος και 10 ml πετρελαϊκού αιθέρα. Ανακινούμε ισχυρά
και αναμένουμε μέχρις ότου να επέλθει διαχωρισμός φάσεων. Η υδατική
φάση απομακρύνεται και η αιθερική στιβάδα πλένεται δύο φορές με
20 ml απεσταγμένου ύδατος. Στη διαχωριστική χοάνη προστίθεται
μικρή ποσότητα άνυδρου θειικού νατρίου, αναδεύουμε, αφήνουμε σε
ηρεμία επί μερικά λεπτά και διηθούμε, συλλέγοντας το διήθημα σε
σωλήνα κωνικού πυθμένα 15 ml.
Ο διαλύτης εξατμίζεται σε υδρόλουτρο σε ρεύμα αζώτου.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 78
Σημείωση 2: Για τον έλεγχο του βρασμού, στο σωλήνα εισάγεται μικρή
γυάλινη ράβδος και η θερμοκρασία του υδρόλουτρου
περιορίζεται στους 90 °C.
3. Παράμετροι ακριβείας
Η στατιστική αξιολόγηση της ακρίβειας των μεθόδων Α και Β δημο-
σιεύτηκε από το διεθνές συμβούλιο ελαιολάδου στον κανονισμό του
COI/T.20/CO. αριθ. 24.
ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΑΕΡΙΑΣ ΦΑΣΗΣ
ΤΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ
ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ
1. Τρόπος εργασίας
Η ανάλυση με χρωματογραφία αέριας φάσης διαλυμάτων λιπαρών εστέ-
ρων σε εξάνιο πραγματοποιείται σύμφωνα με το πρότυπο ISO 5508,
μέσω τριχοειδούς στήλης (50 m μήκος × 0,25 ή 0,32 mm εσωτερική
διάμετρος) καλυμμένης με κυανοπροπυλοσιλικόνη, όπως υποδεικνύεται
για τον προσδιορισμό των trans ισομερών λιπαρών οξέων (COI/T.20/-
Doc. αριθ. 17).
Στην εικόνα 1 παρουσιάζεται το τυπικό χρωματογραφικό προφίλ πυρη-
νελαίου περιέχοντος μεθυλικούς και αιθυλικούς εστέρες λιπαρών οξέων
και trans ισομερή μεθυλικών εστέρων.
2. Υπολογισμοί
2.1. Για να υπολογιστεί η σύσταση σε λιπαρά οξέα και το ΔΕCN42, πρέπει
να λαμβάνονται υπόψη τα ακόλουθα λιπαρά οξέα:
Μυριστικό (C14:0).
Παλμιτικό (C16:0). Άθροισμα των εμβαδών των κορυφών που αντιστοι-
χούν στους μεθυλικούς και αιθυλικούς εστέρες.
Παλμιτελαϊκό (C16:1). Άθροισμα των εμβαδών των κορυφών που αντι-
στοιχούν στα ισομερή ω9 και ω7 του μεθυλικού εστέρα.
Δεκαεπτανοϊκό (C17:0).
Δεκαεπτενοϊκό (C17:1).
Στεατικό (C18:0).
Ελαϊκό (C18:1). Άθροισμα των εμβαδών των κορυφών που αντιστοιχούν
στα ισομερή ω9 και ω7 του μεθυλικού εστέρα, του αιθυλικού εστέρα και
των trans ισομερών του μεθυλικού εστέρα.
Λινελαϊκό (C18:2). Άθροισμα των εμβαδών των κορυφών που αντιστοι-
χούν στους μεθυλικούς και αιθυλικούς εστέρες και στα trans ισομερή
του μεθυλικού εστέρα.
Αραχιδικό (C20:0).
Λινολενικό (C18:3). Άθροισμα των εμβαδών του μεθυλικού εστέρα και
των trans ισομερών του μεθυλικού εστέρα.
Εικοσενοϊκό (C20:1).
Βεχενικό (C22:0).
Λιγνοκηρικό (C24:0).
Το σκουαλένιο δεν λαμβάνεται υπόψη στον υπολογισμό του συνολικού
εμβαδού.
2.2. Για τον υπολογισμό του ποσοστού του trans-C18:1, χρησιμοποιείται η
κορυφή που αντιστοιχεί στους μεθυλικούς εστέρες του λιπαρού αυτού
οξέος. Για το άθροισμα [trans-C18:2 + trans-C18:3], προστίθενται όλες
οι κορυφές που αντιστοιχούν στα trans ισομερή των δύο αυτών λιπαρών
οξέων. Για να υπολογιστεί το συνολικό εμβαδόν, λαμβάνονται υπόψη
όλες οι αναφερόμενες στο 2.1 κορυφές (βλέπε COI/T.20/Doc. αριθ. 17).
Ο υπολογισμός του ποσοστού κάθε λιπαρού οξέος πραγματοποιείται με
τον ακόλουθο τύπο:
% X ¼ ðΕμβαδόν X � 100Þ = ðσυνολικό εμβαδόνÞ
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 79
Εικόνα 1: Χρωματογραφικό προφίλ πυρηνελαίου, ληφθέν με τη μέθοδο της μεθυλίωσης εν ψυχρώ. Οι χρωματογραφικές
κορυφές αντιστοιχούν στους μεθυλεστέρες, εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 80
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XI
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ►C1 ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ◄ ΤΟΥ
ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΣΕ ΑΛΟΓΟΝΟΥΧΟΥΣ ΠΤΗΤΙΚΟΥΣ ΔΙΑΛΥΤΕΣ
1. ΑΡΧΗ
Αεριοχρωματογραφική ανάλυση σύμφωνα με την τεχνική «head space».
2. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
2.1. Συσκευή αερίου χρωματογραφίας, με ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρονίων
(ECD).
2.2. Συσκευή «head space».
2.3. Στήλη αερίου χρωματογραφίας από γυαλί μήκους 2 μέτρων και διαμέτρου
2 mm, ►C1 με στατική φάση ◄. OV101 ως 10 % ή ισοδύναμο, που
εμποτίζει γη διατόμων, η οποία έχει αποτεφρωθεί, εκπλυθεί με οξέα και
μετατραπεί σε σιλάνιο, κοκκομετρικού βαθμού 80 ως 100 Mesh.
2.4. Φέρον αέριο και βοηθητικό αέριο: άζωτο για αέριο χρωματογραφία, ►C1
κατάλληλο για ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρονίων ◄.
2.5. Γυάλινα φιαλίδια 10 ώς 15 ml, με επένδυση από τεφλόν και ένα πώμα από
αλουμίνιο εφοδιασμένο με στόμιο, για δειγματοληψία με σύριγγα.
2.6. Λαβίδες ερμητικού κλεισίματος.
2.7. Σύριγγα για αέριο 0,5 ως 2 ml.
3. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
3.1. Πρότυπα: αλογονούχοι πτητικοί διαλύτες ►C1 χρωματογραφικής καθαρό-
τητας ◄.
4. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
4.1. Ζυγίζουμε ακριβώς 3 g ελαιολάδου περίπου σε ένα γυάλινο φιαλίδιο (μιας
χρήσεως), κλείνουμε το φιαλίδιο ερμητικά. Εισάγουμε το φιαλίδιο σε θερ-
μοστάτη σε 70 °C για μία ώρα. Λαμβάνουμε με ακρίβεια, με τη βοήθεια
σύριγγας, όγκο 0,2 ώς 0,5 ml από το «head space».Το εγχέουμε στη στήλη
της συσκευής αερίου χρωματογραφίας που ρυθμίζεται ως εξής:
— θερμοκρασία έγχυσης: 150 °C,
— θερμοκρασία στήλης: 70 ώς 80 °C,
— θερμοκρασία ανίχνευσης: 200 ως 250 °C.
Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν άλλες θερμοκρασίες στο βαθμό που τα
αποτελέσματα είναι ισοδύναμα.
4.2. Διαλύματα αναφοράς. Προετοιμάζουμε πρότυπα διαλύματα, χρησιμοποιώ-
ντας εξευγενισμένο ελαιόλαδο χωρίς ίχνη διαλυτών, σε συγκεντρώσεις που
κυμαίνονται μεταξύ 0,05 και 1 mg/kg και ανάλογες με την υπολογιζόμενη
περιεκτικότητα του δείγματος. Η ενδεχόμενη διάλυση πρέπει να γίνεται με
πεντάνιο.
4.3. ►C1 Ποσοτικός προσδιορισμός ◄. Συγκρίνουμε τα εμβαδά ή τα ύψη των
κορυφών του φάσματος που αντιστοιχούν στο δείγμα και στο πρότυπο
διάλυμα με την υπολογιζόμενη πλησιέστερη συγκέντρωση. Αν η σχετική
απόκλιση είναι μεγαλύτερη από 10 %, η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί,
συγκρίνοντας με ένα νέο πρότυπο διάλυμα, μέχρι η σχετική συγκέντρωση
να ανταποκρίνεται στη σχετική απόκλιση που προαναφέρεται. Η περιεκτι-
κότητα υπολογίζεται με βάση ένα μέσο όρο των στοιχειωδών εγχύσεων.
4.4. Διατύπωση αποτελεσμάτων. Τα αποτελέσματα ►C1 εκφράζονται ◄ σε
mg/kg (ppm). Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου είναι 0,01 mg/kg.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 81
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XII
ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΘΕΝΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΩΝ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η παρούσα μέθοδος έχει σκοπό τη θέσπιση των αναγκαίων κριτηρίων για
την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων
ελαιολάδων κατά την έννοια του σημείου 1 του παραρτήματος του κανονι-
σμού 136/66/ΕΟΚ και την περιγραφή της σχετικής μεθόδου ταξινόμησής
τους.
Η παρούσα μέθοδος εφαρμόζεται μόνο για την ταξινόμηση των παρθένων
ελαιολάδων, βάσει της ύπαρξης του φρουτώδους γεύσεως και της έντασης
των ελαττωμάτων τους, κατά την κρίση ομάδας επιλεγμένων και εκπαιδευ-
μένων δοκιμαστών, συγκροτημένων σε ομάδα, σύμφωνα με το σημείο 4.
2. ΓΕΝΙΚΑ
Για το γενικό βασικό λεξιλόγιο, η αίθουσα δοκιμών, η γενική μεθοδολογία
καθώς και το ποτήρι δοκιμής των ελαίων συνιστάται να είναι σύμφωνα με
τις προδιαγραφές που προβλέπονται από το διεθνές συμβούλιο ελαιολάδου.
3. ΕΙΔΙΚΟ ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ
3.1. Θετικές ιδιότητες
Φρουτώδες: σύνολο οσφραντικών αισθήσεων, οι οποίες εξαρτώνται από την
ποικιλία των ελαιών και είναι χαρακτηριστικές του ελαίου που προέρχεται
από υγιείς και φρέσκιες ελιές, πράσινες ή ώριμες, το οποίο γίνεται αισθητό
απευθείας από τη μύτη ή από την οπισθορινική οδό.
Πικρό: χαρακτηριστική γεύση ελαιολάδου που έχει ληφθεί από πράσινες
ελιές ή από ελιές που αρχίζει να αλλάζει το χρώμα τους.
Πικάντικο: έντονη κιναισθητική αίσθηση, χαρακτηριστική ελαίων που παρά-
γονται στην αρχή της ελαιοκομικής περιόδου, κυρίως από πράσινες ακόμη
ελιές.
3.2. Αρνητικά χαρακτηριστικά
Ατροχάδο: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που έχει παραληφθεί
από ελιές αποθηκευμένες σε σωρούς και που βρίσκονται σε προχωρημένο
στάδιο αναερόβιας ζύμωσης.
Μουχλιασμένο — νοτισμένο: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδων που
έχουν παραληφθεί από ελιές προσβεβλημένες από μύκητες και ζυμομύκητες
λόγω αποθήκευσης των καρπών για πολλές ημέρες σε περιβάλλον με υγρα-
σία.
Μούργα: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που έχει παραμείνει σε
επαφή με το ίζημα που καθιζάνει σε βαρέλια και δεξαμενές φύλαξης.
Κρασώδες — οξώδες: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδων που θυμί-
ζουν κρασί ή ξύδι. Οφείλεται, βασικά, σε διαδικασία ζύμωσης στις ελιές
που οδηγεί στο σχηματισμό οξικού οξέος, οξικού αιθυλεστέρα και αιθανό-
λης.
Μεταλλική: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που θυμίζει μέταλλο.
Είναι χαρακτηριστική ελαίου που έχει παραμείνει επί μακρόν σε επαφή με
μεταλλικές επιφάνειες, κατά τη διάρκεια της θραύσης του ελαιοκάρπου,
μάλαξης, πίεσης ή αποθήκευσης.
Ταγγό: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδων που έχουν υποστεί διαδικα-
σία οξείδωσης.
Ψημένο ή καμένο: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που προήλθε
από υπερβολική ή/και παρατεταμένη θέρμανση κατά την παραλαβή του
και, ιδιαίτερα, κατά τη θερμομάλαξη της ελαιόπαστας, όταν αυτή πραγμα-
τοποιηθεί σε ακατάλληλες θερμικές συνθήκες.
Άχυρο — ξύλο: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ορισμένων ελαιολάδων που
προέρχονται από ελιές που έχουν αφυδατωθεί.
Τραχύ: χαρακτηριστική πηχτή και ζυμώδης αίσθηση που παράγεται στο
στόμα από ορισμένα έλαια.
Λιπαντικά: οσμή-γεύση ελαιολάδου που θυμίζει πετρέλαιο, γράσο ή ορυκτέ-
λαιο.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 82
Απόνερα: οσμή-γεύση ελαιολάδου που αποκτάται από το ελαιόλαδο ύστερα
από παρατεταμένη επαφή τους με απόνερα του ελαιοτριβείου.
Άλμη: οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές διατηρημένες σε
άλμη.
Σπάρτο: χαρακτηριστική οσμή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές
που έχουν υποστεί έκθλιψη σε καινούργιους σάκους από σπάρτο. Μπορεί
να διαφέρει ανάλογα με το αν πρόκειται για σάκους κατασκευασμένους από
πράσινο ή από ξηρό σπάρτο.
Χωματίλα: οσμή-γεύση ελαιολάδου προερχόμενο από ελιές που έχουν συλ-
λεγεί μαζί με χώμα ή λάσπες και δεν έχουν πλυθεί.
Σκουλήκι: οσμή-γεύση ελαιολάδου που παραλαμβάνεται από ελιές που
έχουν υποστεί σοβαρή προσβολή από νύμφες δάκου της ελαίας (Bactrocera
oleae).
Αγγούρι: Οσμή-γεύση ελαιολάδου που παράγεται όταν το ελαιόλαδο είναι
συσκευασμένο σε ερμητικά κλειστά δοχεία για υπερβολικό χρονικό διά-
στημα και ειδικά σε λευκοσιδηρά δοχεία, και η οποία αποδίδεται στο σχη-
ματισμό 2,6-εννεανοδιενάλης.
4. ΟΜΑΔΑ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ
Η ομάδα ορίζεται από το κράτος μέλος και αποτελείται από τον επικεφαλής
της ομάδας και από οκτώ έως δώδεκα δοκιμαστές. Ωστόσο, για την περίοδο
2001-2002 οι δοκιμαστές μπορεί να είναι λιγότεροι από οκτώ.
Ο επικεφαλής της ομάδας πρέπει να είναι εξαιρετικά καταρτισμένος, γνώ-
στης και με ιδιαίτερη εμπειρία στους διάφορους τύπους ελαίων. Είναι υπεύ-
θυνος για την ομάδα, την οργάνωση και τη λειτουργία της, την προετοιμα-
σία, την κωδικοποίηση και την παρουσίαση των δειγμάτων στους δοκιμα-
στές, καθώς και για τη συλλογή των δεδομένων και τη στατιστική τους
επεξεργασία.
Ο επικεφαλής της ομάδας επιλέγει τους δοκιμαστές και επιβλέπει για την
εκπαίδευσή τους και τον έλεγχο των επιδόσεών τους, ώστε οι ικανότητές
τους να διατηρούνται πάντοτε σε ικανό επίπεδο.
Οι δοκιμαστές για τους οργανοληπτικούς ελέγχους του ελαιολάδου πρέπει
να επιλέγονται και να εκπαιδεύονται ανάλογα με την ικανότητά τους στη
διάκριση μεταξύ παρομοίων δειγμάτων, σύμφωνα με τον οδηγό του διε-
θνούς συμβουλίου ελαιολάδου για την επιλογή, την εκπαίδευση και τον
έλεγχο των χαρακτηρισμένων ως δοκιμαστών παρθένου ελαιολάδου.
Οι ομάδες οργανοληπτικής εξέτασης πρέπει να συμμετέχουν στις οργανο-
ληπτικές αξιολογήσεις που προβλέπονται σε εθνικό, κοινοτικό ή διεθνές
επίπεδο για τον περιοδικό έλεγχο και την εναρμόνιση των κριτηρίων αντί-
ληψης. Εξάλλου, πρέπει να παρέχουν κάθε χρόνο στο συγκεκριμένο κράτος
μέλος κάθε πληροφορία σχετικά με τη σύνθεση και τον αριθμό των αξιο-
λογήσεων που πραγματοποίησαν ως αναγνωρισμένη ομάδα.
5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΚΑΤΑ-
ΤΑΞΗ
5.1. Χρησιμοποίηση του φύλλου χαρακτηριστικών από τον δοκιμαστή
Το φύλλο χαρακτηριστικών που χρησιμοποιείται από τον δοκιμαστή εμφαί-
νεται στο προσάρτημα A της παρούσας μεθόδου.
Κάθε δοκιμαστής που αποτελεί μέλος της ομάδας πρέπει να οσφραίνεται
και στη συνέχεια να γεύεται (1) το υπό εξέταση έλαιο, το οποίο περιέχεται
στο ποτήρι δοκιμής, προκειμένου να αναλύσει τις αντιλήψεις του από πλευ-
ράς όσφρησης, γεύσης, αφής και κιναισθησίας. Στη συνέχεια, πρέπει να
καταγράφει στο φύλλο χαρακτηριστικών που έχει στη διάθεσή του, την
ένταση με την οποία αντιλαμβάνεται καθεμία από τις αρνητικές και θετικές
ιδιότητες.
Στην περίπτωση όπου γίνουν αντιληπτές αρνητικές ιδιότητες που δεν ανα-
φέρονται στο φύλλο χαρακτηριστικών, αυτές πρέπει να καταγράφονται στο
χώρο με το χαρακτηρισμό «άλλες», χρησιμοποιώντας τον ή τους όρους που
τις περιγράφουν με τη μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια μεταξύ εκείνων που
ορίζονται στο σημείο 3.2 της παρούσας μεθόδου.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 83
(1) Όταν παρατηρήσει ορισμένες εξαιρετικά αρνητικές ιδιότητες, μπορεί να απόσχει της
πρόγευσης και να σημειώσει στο φύλλο χαρακτηρισμού την εξαιρετική αυτή κατάσταση.
5.2. Χρήση των δεδομένων από τον επικεφαλής της ομάδας
Ο επικεφαλής της ομάδας πρέπει να μαζεύει τα φύλλα χαρακτηριστικών που
έχουν συμπληρωθεί από τους δοκιμαστές και να ελέγχει τις αποδοθείσες
εντάσεις των ιδιοτήτων. Σε περίπτωση εντοπισμού κάποιας ανωμαλίας, ζητά
από τον δοκιμαστή να αναθεωρήσει το φύλλο χαρακτηριστικών και, αν
κρίνει αναγκαίο, να επαναλάβει τη δοκιμή.
Ο επικεφαλής της ομάδας μπορεί θα εισαγάγει τα δεδομένα κάθε δοκιμαστή
σε πρόγραμμα πληροφορικής σύμφωνο με τη μέθοδο του στατιστικού υπο-
λογισμού της διάμεσης τιμής που εμφαίνεται στο προσάρτημα B. Η εισ-
αγωγή των δεδομένων για ένα δείγμα πρέπει να γίνεται με τη βοήθεια
πίνακα αποτελούμενου από δέκα στήλες αντιστοιχούσες στις δέκα αισθητη-
ριακές ιδιότητες και n γραμμές αντιστοιχούσες στους n δοκιμαστές της
ομάδας.
Όταν κάποια αρνητική ιδιότητα έχει καταγραφεί στη στήλη «άλλες» από το
50 % τουλάχιστον της ομάδας, ο επικεφαλής πρέπει να προβαίνει στον
υπολογισμό της διάμεσης τιμής της ιδιότητας αυτής και στην αντίστοιχη
κατάταξη.
Σε περίπτωση αναλύσεων που πραγματοποιούνται στο πλαίσιο ελέγχων
συμφωνίας με το πρότυπο ή κατ' έφεση εξετάσεων, ο επικεφαλής της ομά-
δας πρέπει να προβαίνει σε τριπλή οργανοληπτική αξιολόγηση του ελαίου,
με μία τουλάχιστον ημέρα διάλειμμα. Η διάμεση τιμή των ιδιοτήτων υπο-
λογίζεται από το σύνολο των δεδομένων των φύλλων χαρακτηριστικών των
τριών δοκιμών.
5.3. Κατάταξη των ελαίων
Το έλαιο κατατάσσεται στις ακόλουθες κατηγορίες, ανάλογα με τη διάμεση
τιμή των ελαττωμάτων και τη διάμεση τιμή της φρουτώδους ιδιότητας. Με
τον όρο διάμεση τιμή των ελαττωμάτων νοείται η διάμεση τιμή της αρνη-
τικής ιδιότητας που γίνεται αντιληπτή με τη μεγαλύτερη ένταση. Η τιμή του
ανθεκτικού συντελεστή διακύμανσης για αυτή την αρνητική ιδιότητα πρέπει
να είναι μικρότερη ή ίση με 20 %.
α) Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι
ίση με 0 και η διάμεση τιμή για το φρουτώδες είναι μεγαλύτερη του 0.
β) Παρθένο ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μεγαλύτερη
του 0 και μικρότερη ή ίση με 2,5 και η διάμεση τιμή για το φρουτώδες
είναι μεγαλύτερη του 0.
γ) Κοινό παρθένο ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μεγα-
λύτερη του 2,5 και μικρότερη ή ίση του 6,0· ή η διάμεση τιμή των
ελαττωμάτων είναι μικρότερη ή ίση με το 2,5 και η διάμεση τιμή για
το φρουτώδες είναι ίση με 0.
δ) Λαμπάντε παρθένο ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι
μεγαλύτερη του 6,0.
Ωστόσο, από την 1η Νοεμβρίου 2003, οι κατηγορίες γ) και δ) αντικαθί-
στανται από την κατηγορία:
γ) Λαμπάντε ελαιόλαδο: η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μεγαλύ-
τερη του 2,5· ή η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μικρότερη ή ίση
με 2,5 και η διάμεση τιμή για το φρουτώδες είναι ίση με 0.
5.4. Ιδιαίτερες περιπτώσεις
Όταν η διάμεση τιμή θετικής ιδιότητας εκτός του φρουτώδους είναι μεγα-
λύτερη του 5,0, ο επικεφαλής της ομάδας το σημειώνει στο πιστοποιητικό
ανάλυσης του ελαίου.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 84
ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ A
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 85
ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ B
ΜΕΘΟΔΟΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΔΙΑΜΕΣΗΣ ΤΙΜΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΟΡΙΩΝ
ΕΜΠΙΣΤΟΣΥΝΗΣ
Διάμεση τιμή
Διάμεση τιμή είναι ο πραγματικός αριθμός Xm που χαρακτηρίζεται από το
γεγονός ότι η πιθανότητα (P) οι τιμές της κατανομής (X) να είναι μικρότερες
από τον αριθμό αυτό (Xm), είναι μικρότερη ή ίση με 0,5 και ότι, ταυτόχρονα, η
πιθανότητα (P) οι τιμές της κατανομής (X) να είναι μικρότερες ή ίσες με Xm,
είναι μεγαλύτερη ή ίση με 0,5. Ένας άλλος ορισμός ορίζει τη διάμεση τιμή ως το
50ό εκατοστημόριο διαμερισμού μιας κατανομής αριθμών διατεταγμένων κατ'
αύξουσα τάξη. Με άλλα λόγια, η διάμεση τιμή αντιπροσωπεύει την κεντρική
τιμή μιας διατεταγμένης σειράς περιττού πλήθους ή το μέσο όρο των δύο κεν-
τρικών τιμών μιας διατεταγμένης σειράς άρτιου πλήθους.
Ανθεκτική τυπική απόκλιση
Για να υπάρχει μια αξιόπιστη εκτίμηση της διακύμανσης που παράγεται γύρω
από τη διάμεση τιμή, πρέπει να αναφερθούμε στην εκτίμηση της ανθεκτικής
τυπικής απόκλισης κατά Stuart et Kendall. Ο τύπος της ασυμπτωτικής τυπικής
απόκλισης S εξαρτάται από το N και το IQR. N είναι ο αριθμός των παρατη-
ρήσεων και IQR το διατεταρτημοριακό διάστημα, δηλαδή η σταθερή εκτίμηση
της διακύμανσης των εξεταζόμενων δεδομένων (το διατεταρτημοριακό διάστημα
περικλείει ακριβώς το 50 % των περιπτώσεων μιας οποιασδήποτε κατανομής
πιθανότητας). Ο υπολογισμός του διατεταρτημοριακού διαστήματος πραγματο-
ποιείται υπολογίζοντας το μέγεθος της απόκλισης μεταξύ του 75ου και του 25ου
εκατοστημορίου.
IQR ¼ 75ο � 25ο εκατοστημόριο
Εκατοστημόριο είναι η τιμή Xpc που χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι η
πιθανότητα (P) οι τιμές της κατανομής να είναι μικρότερες της Xpc είναι μικρό-
τερη ή ίση με ένα καθορισμένο εκατοστό και ότι, ταυτόχρονα, η πιθανότητα (P)
οι τιμές της κατανομής να είναι μικρότερες ή ίσες με τη Xpc είναι μεγαλύτερη ή
ίση με το εν λόγω εκατοστό. Εκατοστό είναι το κλάσμα της λαμβανόμενης
κατανομής. Στην περίπτωση της διάμεσης τιμής, αυτή είναι ίση με το 50/100.
Με άλλα λόγια, εκατοστημόριο είναι η τιμή κατανομής που αντιστοιχεί σε
καθορισμένο εμβαδόν χαρασσόμενο από την καμπύλη κατανομής ή πυκνότητας.
Για παράδειγμα, το 25ο εκατοστημόριο αντιπροσωπεύει την τιμή κατανομής που
αντιστοιχεί σε εμβαδόν ίσο με 0,25 ή 25/100.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 86
Ανθεκτικός συντελεστής διακύμανσης %
Ο CVR είναι καθαρός αριθμός, δηλαδή χωρίς διαστάσεις, που δείχνει το ποσο-
στό διακύμανσης της αναλυόμενης σειράς αριθμών σε σχέση με την τιμή Me της
διάμεσης τιμής. Για το λόγο αυτό, ο συντελεστής αυτός είναι πολύ χρήσιμος για
την επαλήθευση της αξιοπιστίας των μελών της ομάδας.
Όρια εμπιστοσύνης 95 % στη διάμεση τιμή
Τα όρια εμπιστοσύνης (I.C.) με πιθανότητα 95 % (τιμή σφάλματος πρώτου
είδους ίση με 0,05 ή 5 %) αντιπροσωπεύουν τα όρια όπου η διάμεση τιμή θα
μπορούσε να κυμαίνεται αν υποτεθεί ότι είναι δυνατή η επανάληψη του πειρά-
ματος άπειρες φορές. Στην πράξη, το εύρος αυτό δείχνει την περιοχή διακύμαν-
σης της δοκιμής υπό τις κρατούσες λειτουργικές συνθήκες, με την υπόθεση ότι η
δοκιμή θα μπορεί να επαναληφθεί πολλές φορές. Το εύρος βοηθά στην εκτίμηση,
όπως και στην περίπτωση του CVR %, της αξιοπιστίας της δοκιμής.
I:C: ανώτατο ¼ Me þ ðc:SÞ
I:C: S κατώτατο ¼ Me � ðc:SÞ
όπου c, στην περίπτωση των ορίων εμπιστοσύνης 0,95, είναι 1,96.
Η κατάταξη γίνεται συγκρίνοντας τις διάμεσες τιμές με τα διαστήματα αναφοράς
που καθορίζονται στο σημείο 5.3 της μεθόδου. Το λογισμικό επιτρέπει την
οπτική απεικόνιση της κατάταξης σε πίνακα στατιστικών δεδομένων ή σε γρά-
φημα.
▼M20
_______
▼M19
_______
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 87
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XV
1. ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΕ ΕΛΑΙΟ ΤΩΝ ΕΛΑΙΟΠΥΡΗΝΩΝ
1.1. Εξοπλισμός
— κατάλληλη συσκευή εκχυλίσεως εφοδιασμένη με σφαιρική φιάλη των
200 έως 250 ml,
— λουτρό ηλεκτρικής θερμάνσεως (αμμόλουτρο, υδρόλουτρο κ.λπ.) θερ-
μαινόμενη πλάκα,
— αναλυτικός ζυγός,
— φούρνος ρυθμισμένος στους 80 °C το μέγιστο,
— φούρνος ηλεκτρικής θερμάνσεως εφοδιασμένος με θερμοστατικό μηχά-
νημα, ρυθμισμένος στους 103 ± 2 ° C με μηχανισμό εμφυσήσεως αέρος
η μειώσεως της πιέσεως,
— μηχανικός μύλος εύκολα καθαριζόμενος, που να επιτρέπει τη σύνθλιψη,
χωρίς να επιφέρει ανύψωση της θερμοκρασίας ή αισθητή μεταβολή της
περιεκτικότητος σε υγρασία και έλαιο,
— ►C1 φύσιγγα εκχυλίσεως και υδρόφιλος βάμβαξ ◄ ή διηθητικός χάρ-
της, απαλλαγμένα συστατικών εκχυλιζομένων με το εξάνιο,
— ξηραντήρας,
— κόσκινο διαμέτρου οπών 1 mm,
— μικρά τεμαχίδια ξηρανθείσης ελαφρόπετρας.
1.2. Αντιδραστήρια
Κανονικό εξάνιο (technical grade), το οποίο μετά από πλήρη εξάτμιση να
αφήνει υπόλειμμα το πολύ 0,002 g ανά 100 ml.
2. ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ
2.1. Παρασκευή του δείγματος δοκιμής
Αλέθουμε το εργαστηριακό δείγμα εάν παρίσταται ανάγκη, με μηχανικό
μύλο, καλά καθαρισμένο, ώστε νά λάβουμε τεμάχια που να δύνανται να
διέλθουν από το κόσκινο.
Χρησιμοποιούμε το εικοστό περίπου του δείγματος για τον πλήρη καθαρι-
σμό του μύλου, απορρίπτουμε το άλεσμα αυτό, αλέθουμε την υπόλοιπη
ποσότητα, τη συλλέγουμε, την αναμειγνύουμε προσεκτικά και την ανα-
λύουμε αμέσως.
2.2. Ποσότης δοκιμής
Μόλις ολοκληρωθεί η εργασία λειοτριβήσεως, ζυγίζουμε 10 g του δείγματος
δοκιμής με ακρίβεια 0,01 g.
2.3. Προετοιμασία των εκχυλιστικών δακτυλίων (cartouche)
Τοποθετούμε το δείγμα δοκιμής εντός του δακτύλιου και πωματίζουμε με
►C1 υδρόφιλο βάμβακα ◄. Αν χρησιμοποιείται διηθητικός χάρτης, το
άλεσμα τυλίγεται μέσα σ' αυτόν.
2.4. Προκαταρκτική ξήρανση
Αν ο ελαιοπυρήνας είναι πολύ υγρός (παραδείγματος χάρη περιεκτικότητα
σε υγρασία και πτητικές ύλες άνω του 10 %), ξηραίνουμε αυτόν προκαταρ-
κτικώς διά τοποθετήσεως του ετοίμου δακτυλίου (ή του διηθητικού χάρτου)
επί τι χρονικό διάστημα μέσα σε φούρνο θερμανθέντα σε θερμοκρασία όχι
ανώτερη των 80 °C γιά να ελαττώσουμε την περιεκτικότητα σε υγρασία και
πτητικές ύλες κάτω του 10 %.
2.5. Προετοιμασία της σφαιρικής φιάλης
Ζυγίζουμε, με ακρίβεια 1 mg, φιάλη περιέχουσα ένα ή δύο τεμαχίδια ελα-
φρόπετρας, προηγουμένως ξηρανθείσα μέσα σε φούρνο στούς 103 ± 2 °C
και εν συνεχεία ψυχθείσα μέσα σε ξηραντήρα γιά διάστημα τουλάχιστον
μίας ώρας.
2.6. Πρώτη εκχύλιση
Μέσα στη συσκευή εκχυλίσεως εισάγουμε ►C1 τη φύσιγγα ◄ (ή το
διηθητικό χάρτη) που περιέχει την ποσότητα δοκιμής. Χύνουμε εντός της
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 88
σφαιρικής φιάλης την απαραίτητη ποσότητα εξανίου. Συνδέουμε τη φιάλη
με τή συσκευή εκχυλίσεως και το σύνολο τοποθετείται στο ηλεκτρικά θερ-
μαινόμενο λουτρό. Ρυθμίζουμε τη θέρμανση κατά τέτοιο τρόπο ώστε η
ταχύτης επαναρροής να είναι τουλάχιστον 3 σταγόνες το δευτερόλεπτο
(βρασμός μέτριος, όχι ισχυρός).
Μετά τέσσερις ώρες εκχυλίσεως ψύχουμε. Απομακρύνουμε ►C1 τη
φύσιγγα ◄ από τη συσκευή εκχυλίσεως και το θέτουμε σε ρεύμα αέρος
για να απομακρύνουμε τον εμποτισθέντα διαλύτη.
2.7. Δεύτερη εκχύλιση
Αδειάζουμε ►C1 τη φύσιγγα ◄ εντός μικρο-αλεστήρος και αλέθουμε σε
όσο το δυνατό λεπτότερα τεμάχια Επαναφέρουμε το μείγμα πάλι μέσα
►C1 στη φύσιγγα ◄ ποσοτικά και τοποθετούμέ το δακτύλιο μέσα στη
συσκευή εκχυλίσεως.
Συνεχίζουμε την εκχύλιση για δύο επιπλέον ώρες, χρησιμοποιώντας την ίδια
σφαιρικη φιάλη που περιέχει το πρώτο εκχύλισμα.
Το λαμβανόμενο στη φιάλη εκχυλίσεως διάλυμα πρέπει να είναι διαυγές. Αν
δεν είναι, το διηθούμε με διηθητικό χάρτη και ξεπλένουμε την αρχική φιάλη
και το διηθητικό χάρτη αρκετές φορές με εξάνιο. Συλλέγουμε το διήθημα
και το διαλύτη της πλύσεως εντός δευτέρας σφαιρικής φιάλης, η οποία έχει
προηγουμένως ξηρανθεί και ζυγισθεί με ακρίβεια 1 mg.
2.8. Απομάκρυνση του διαλύτου και ζύγιση του εκχυλίσματος
Απομακρύνουμε το μεγαλύτερο μέρος του διαλύτου δι' αποστάξεως επί
ηλεκτρικώς θερμαινομένου λουτρού. Απομακρύνουμε τα τελευταία ίχνη
του διαλύτου θερμαίνοντας τη φιάλη μέσα σε φούρνο στους
103 ° ± 2 °C για 20 λεπτά. Διευκολύνουμε την απομάκρυνση αυτή είτε
δι' εμφυσήσεως, κατά διαλείμματα αέρος, ή προτιμότερο αδρανούς αερίου,
είτε διά μειώσεως της πιέσεως.
Αφήνουμε τη φιάλη να ψυχθεί μέσα σε ξηραντήρα επί μια τουλάχιστον ώρα
και ζυγίζουμε με ακρίβεια 1 mg.
Θερμαίνουμε εκ νέου για 10 λεπτά με τις ίδιες συνθήκες, ψύχουμε μέσα
στον ξηραντήρα και ζυγίζουμε.
Η διαφορά μεταξύ των δύο ζυγίσεων δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10 mg.
Αν όχι, θερμαίνουμε εκ νέου για διάστημα 10 λεπτών, ψύχουμε και ζυγί-
ζουμε, επαναλαμβάνοντας την εργασία μέχρις ότου η διαφορά βάρους
μεταξύ δύο ζυγίσεων να μην είναι μεγαλύτερη από 10 mg. Λαμβάνουμε
υπόψη την τελευταία ζύγιση της φιάλης.
Εκτελούμε δύο προσδιορισμούς επί του αυτού δείγματος δοκιμής.
3. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
3.1. Τρόπος υπολογισμού και τύπος
α) Το εκχύλισμα εκπεφρασμένο επί τοις εκατό κατά μάζα του προϊόντος ως
έχει, ισούται με:
S ¼ m1 � 100m0
όπου:
S = είναι το ποσοστό επί τοις % κατά μάζα του εκχυλίσματος του
προϊόντος ως έχει,
m0 = είναι η μάζα, σε γραμμάρια, της ποσότητος δοκιμής,
m1 = είναι η μάζα, σε γραμμάρια, του εκχυλίσματος μετά την
ξήρανση.
Λαμβάνουμε ως αποτέλεσμα τον αριθμητικό μέσο όρο των δύο προσδιο-
ρισμών εφόσον πληρούνται οι προϋποθέσεις επαναληπτικότητος.
Εκφράζουμε το αποτέλεσμα με ένα δεκαδικό ψηφίο.
β) Το εκχύλισμα ανάγεται επί ξηράς ουσίας με τον ακόλουθο τύπο:
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 89
S � 100
100 � U = εκχύλισμα επί τοις εκατό λιπαρό ξηρό.
όπου:
S = είναι το ποσοστό κατά μάζα του εκχυλίσματος του προϊόντος ως
έχει [βλέπε στοιχείο α)],
U = είναι η περιεκτικότης σε υγρασία και πτητικές ύλες.
3.2. Επαναληπτικότης
Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών, οι οποίοι
πραγματοποιούνται συγχρόνως ή ταχέως ο ένας μετά τον άλλο από τον ίδιο
αναλύτη, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,2 g εκχυλίσματος εξανίου ανά
100 g δείγματος.
Σε αντίθετη περίπτωση, επαναλαμβάνουμε την ανάλυση με δύο άλλες ποσό-
τητες δοκιμής. Αν και πάλι η διαφορά υπερβαίνει τα 0,2 g, λαμβάνουμε ως
αποτέλεσμα τον αριθμητικό μέσο όρο των τεσσάρων πραγματοποιηθέντων
προσδιορισμών.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 90
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVI
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΙΩΔΙΟΥ
1. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
►C1 Η διεθνής αυτή προδιαγραφή περιγράφει ◄ μέθοδο προσδιορισμού
του αριθμού ιωδίου στα ζωικά και φυτικά λίπη και έλαια το οποία αναφέ-
ρονται στο εξής ως λιπαρές ουσίες.
2. ΟΡΙΣΜΟΣ
►C1 Για τους σκοπούς της παρούσης διεθνούς προδιαγραφής ◄ εφαρμό-
ζεται ο ακόλουθος ορισμός:
2.1. Αριθμός ιωδίου· η μάζα του ιωδίου που απορροφάται από το δείγμα υπό τις
συνθήκες εργασίας που καθορίζονται στο παρόν διεθνές πρότυπο.
Ο αριθμός ιωδίου εκφράζεται σε γραμμάρια ιωδίου ανά 100 g δείγματος.
3. ΑΡΧΗ
Διάλυση του δείγματος στο διαλύτη και προσθήκη αντιδραστήριου Wijs.
Προσθήκη μετά την πάροδο καθορισμένου χρόνου διαλύματος ιωδιούχου
καλίου και νερού και τιτλοδότηση του ιωδίου που ελευθερώθηκε με διά-
λυμα θειοθειικού νατρίου.
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι ανεγνωρισμένης αναλυτική καθαρό-
τητας.
4.1. Ιωδιούχο κάλιο, διάλυμα 100 g/l, απαλλαγμένο ιωδικών ιόντων ή ελευθέρου
ιωδίου.
4.2. Διάλυμα αμύλου
Αναμειγνύονται 5 g διαλυτού αμύλου με 30 ml ύδατος, το μείγμα διαλύεται
με 1 000 ml ζέοντος ύδατος, ζέεται επί 3 λεπτά και αφήνεται να ψυχθεί.
4.3. Θειοθειικό νάτριο, πρότυπο διάλυμα C (Na2S2O3 · 5H2O) = 0,1 mol/l, το
οποίο έχει τιτλοδοτηθεί το πολύ 7 ημέρες πριν από τη χρήση.
4.4. Διαλύτης, για την παρασκευή του οποίου αναμείχθηκαν ίσοι όγκοι κυκλοε-
ξανίου και οξικού οξέος.
4.5. Αντιδραστήριο Wijs, ήτοι διάλυμα μονοχλωριούχου ιωδίου σε οξικό οξύ.
Χρησιμοποιείται αντιδραστήριο Wijs του εμπορίου.
Σημείωση: Το αντιδραστήριο περιέχει 9 g ICL3 + 9 g I σε οξικό οξύ.
5. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΚΕΥΗ
Συνήθη εργαστηριακά όργανα και σκεύη και ιδίως τα κατωτέρω:
5.1. Γυάλινα κοχλιάρια ζυγίσεως κατάλληλα για την ελεγχόμενη ποσότητα και
για την εισαγωγή της στις φιάλες (5.2).
5.2. Κωνικές φιάλες χωριτικότητας 500 ml με εσμυρισμένα πώματα και τελείως
ξηρές.
6. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ
Το ομογενοποιημένο δείγμα ξηραίνεται με θειικό νάτριο και διηθείται.
7. ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ
7.1. Βάρος δείγματος
Το βάρος του δείγματος ποικίλλει ανάλογα με τον αναμενόμενο αριθμό
ιωδίου όπως προκύπτει από τον πίνακα 1.
Πίνακας Ι
Αναμενόμενος αριθμός ιωδίου Βάρος δείγματος (g)
μικρότερος από 5 3,00
5 έως 20 1,00
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 91
Αναμενόμενος αριθμός ιωδίου Βάρος δείγματος (g)
21 έως 50 0,40
51 έως 100 0,20
101 έως 150 0,13
151 έως 200 0,10
Το δείγμα ζυγίζεται με προσέγγιση 0,1 mg στο γυάλινο κοχλιάριο ζυγίσεως
(5.1).
7.2. Ποσοτικός προσδιορισμός
Το ζυγισθέν δείγμα φέρεται σε κωνική φιάλη των 500 ml (5.2). Προστίθε-
νται 20 ml διαλύτη (4.4) για τη διάλυση της λιπαράς ουσίας. Ακολούθως
προστίθενται επακριβώς 25 ml αντιδραστηρίου Wijs (4.5), τοποθετείται το
πώμα, η φιάλη ανακινείται και τοποθετείται σε σκοτεινό μέρος. Για τη λήψη
του αντιδραστηρίου Wijs δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί σιφώνιο που απαιτεί
αναρρόφηση με το στόμα.
Κατά τον ίδιο τρόπο παρασκευάζεται το τυφλό διάλυμα με διαλύτη και
αντιδραστήριο αλλά χωρίς δείγμα.
Για τα δείγματα των οποίων η τιμή ιωδίου είναι μικρότερη από 150, οι
φιάλες αφήνονται σε σκοτεινό μέρος επί 1 ώρα. Όταν πρόκειται για δείγ-
ματα με αριθμό ιωδίου μεγαλύτερο από 150 και για πολυμερισμένα προϊό-
ντα ή προϊόντα με σημαντικό βαθμό οξείδωσης, οι φιάλες αφήνονται σε
σκοτεινό μέρος επί 2 ώρες.
Μετά την πάροδο του απαιτούμενου χρόνου προστίθενται σε καθεμία από
τις φιάλες 20 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (4.1) και 150 ml νερού.
Ακολουθεί ογκομέτρηση με το πρότυπο διάλυμα θειοθειικού νατρίου (4.3)
έως ότου εξαφανισθεί σχεδόν τελείως το κίτρινο χρώμα που οφείλεται στο
ιώδιο. Προστίθενται λίγες σταγόνες διαλύματος αμύλου (4.2) και η ογκομέ-
τρηση συνεχίζεται μέχρι την πρώτη εξαφάνιση του κυανού χρώματος μετά
από ισχυρή ανάδευση.
Σημείωση: Ο ποτενσιομετρικός προσδιορισμός του τέλους της αντιδράσεως
επιτρέπεται.
7.3. Αριθμός προσδιορισμών
Για κάθε δείγμα πραγματοποιούνται δύο ποσοτικοί προσδιορισμοί.
8. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Ο αριθμός ιωδίου δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:
12; 69 c ðV1 � V2Þ
m
όπου:
c = η αριθμητική τιμή της ακριβούς συγκεντρώσεως, σε mol ανά λίτρο,
του προτύπου διαλύματος θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιμο-
ποιήθηκε,
V1 = η αριθμητική τιμή του όγκου, σε ml, του προτύπου διαλύματος
θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιμοποιήθηκε για την τυφλή δοκι-
μασία,
V2 = η αριθμητική τιμή του όγκου, σε ml, του προτύπου διαλύματος
θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό
προσδιορισμό,
m = η αριθμητική τιμή της μάζας, σε g, του δείγματος (7.1).
Λαμβάνεται ως αποτέλεσμα ο αριθμητικός μέσος όρος των δύο προσδιορι-
σμών, υπό την προϋπόθεση ότι τηρούνται οι απαιτήσεις όσον αφορά την
επαναληψιμότητα.
▼B
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 92
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVII
ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΣΤΑΔΙΕΝΙΩΝ ΣΕ
ΦΥΤΙΚΑ ΕΛΑΙΑ
1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Προσδιορισμός των στιγματαδιενίων σε φυτικά έλαια χαμηλής περιεκτι-
κότητας στους εν λόγω υδρογονάνθρακες, κυρίως σε παρθένα ελαιόλαδα
και σε ακατέργαστα πυρηνέλαια.
2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η μέθοδος είναι εφαρμόσιμη για όλα τα φυτικά έλαια, οι μετρήσεις όμως
είναι αξιόπιστες μόνον όταν η περιεκτικότητα του ελαίου στους εν λόγω
υδρογονάνθρακες περιλαμβάνεται μεταξύ των τιμών 0,01 και 4,0 mg/kg.
Η μέθοδος προσφέρεται κυρίως για την ανίχνευση της παρουσίας εξευ-
γενισμένων (ραφιναρισμένων) φυτικών ελαίων (ελαιολάδων, πυρηνε-
λαίων, ηλιανθελαίων, φοινικελαίων, κ.λπ.) στο παρθένο ελαιόλαδο,
αφού τα εξευγενισμένα έλαια περιέχουν στιγμασταδιένια ενώ τα παρθένα
όχι.
3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Απομόνωση των ασαπωνοποίητων υλών, διαχωρισμός του κλάσματος
στεροειδών υδρογονανθράκων με χρωματογραφία στήλης επί πηκτής διο-
ξειδίου του πυριτίου (silica gel) και ανάλυση με αέριο χρωματογραφία
τριχοειδούς στήλης.
4. ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ
4.1. Φιάλες των 250 ml με επίπεδο πυθμένα κατάλληλες για χρήση με
ψυκτήρα αναρροής.
4.2. Διαχωριστικές χοάνες των 500 ml.
4.3. Σφαιρικές φιάλες των 100 ml.
4.4. Περιστροφικός εξατμιστήρας.
4.5. Υάλινη στήλη χρωματογραφίας εσωτερικής διαμέτρου 1,5-2,0 cm και
μήκους 50 cm, με στρόφιγγα Teflon και βύσμα από υαλοβάμβακα ή
δίσκο από συντετηγμένο γυαλί στον πυθμένα. Για να ετοιμαστεί η
στήλη silica gel, εισάγεται μέσα στην υάλινη στήλη εξάνιο μέχρι ύψους
5 cm περίπου και εν συνεχεία η στήλη πληρούται με υδαρές μείγμα silica
gel και εξανίου (15 g σε 40 ml) το οποίο προστίθεται τμηματικά. Το
περιεχόμενο της στήλης αφήνεται σε ηρεμία και η καθίζηση ολοκληρώ-
νεται με ελαφρά ανατάραξη. Προστίθεται άνυδρο θειικό νάτριο μέχρι
ύψους 0,5 cm περίπου και τέλος εκλούεται η περίσσεια εξανίου.
4.6. Χρωματογράφος αερίου με ανιχνευτή ιονισμού δια φλογός, split ή διά-
ταξη έγχυσης εν ψυχρώ, ενσωματωμένη στη στήλη και κλίβανος προ-
γραμματιζόμενης θερμοκρασίας με ακρίβεια ± 1 °C.
4.7. Τριχοειδής στήλη από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου για αέριο χρωμα-
τογραφία (εσωτερικής διαμέτρου 0,25 ή 0,30 mm και μήκους 25 m), με
επίστρωση από 5 % - φαινυλομεθυλοσιλικόνη πάχους 0,25 mm.
Σημείωση 1.
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες στήλες ανάλογης ή μικρότερης
πολικότητας.
4.8. Καταγραφέας-ολοκληρωτής με δυνατότητα ολοκλήρωσης κοιλάδα προς
κοιλάδα.
4.9. Μικροσύριγγα των 5-10 ml για αέριο χρωματογραφία με σκληρυμμένη
βελόνη.
4.10. Ηλεκτρικό θερμαντήρα ή εστία.
5. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητος, εκτός
εάν διευκρινίζεται διαφορετικά. Το χρησιμοποιούμενο νερό πρέπει να
είναι απεσταγμένο ή τουλάχιστον ισοδύναμης καθαρότητας.
5.1. Εξάνιο ή μείγμα αλκανίων σημείου ζέσεως 65-70 °C, αποσταζόμενο σε
αποστακτική ύλη.
▼M11
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 93
Σημείωση 2.
Ο διαλύτης πρέπει να αποστάζεται ώστε να απομακρύνονται οι ξένες
προσμείξεις.
5.2. Αιθανόλη 96 κ.ό.
5.3. Άνυδρο θειικό νάτριο.
5.4. Αλκοολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 10 %. Προστίθενται 10 ml
ύδατος σε 50 g υδροξειδίου του καλίου, το διάλυμα αναδεύεται και εν
συνεχεία αραιώνεται με αιθανόλη μέχρις όγκου 500 ml.
Σημείωση 3.
Το αλκοολικό διάλυμα ποτάσας γίνεται φαιόχρουν όσο παραμένει· γι'
αυτό πρέπει να παρασκευάζεται σε ημερήσια βάση και να φυλάσσεται
σε καλώς πωματισμένες σκούρες υάλινες φιάλες.
5.5. Silica gel 60 για χρωματογραφία στήλης, άνοιγμα βροχίδων 70-230 (αριθ.
αναφ. Merck 7734 ή ανάλογος).
Σημείωση 4.
Η silica gel μπορεί συνήθως να χρησιμοποιείται απευθείας από το δοχείο
χωρίς προηγούμενη επεξεργασία. Ωστόσο, μερικές παρτίδες ενδέχεται να
παρουσιάσουν χαμηλού βαθμού δραστηριότητα με αποτέλεσμα κακής
ποιότητας χρωματογραφικό διαχωρισμό. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η επε-
ξεργασία της silica gel πρέπει να γίνεται με τον ακόλουθο τρόπο: αποε-
νεργοποιείται η silica gel με θέρμανση επί τέσσερις τουλάχιστον ώρες σε
θερμοκρασία 550 °C. Μετά τη θέρμανση, τοποθετείται σε ξηραντήρα
ενόσω ψύχεται, και εν συνεχεία μεταφέρεται σε πωματισμένη φιάλη.
Προστίθεται 2 % ύδατος και η φιάλη αναταράσσεται μέχρις ότου δεν
υπάρχουν πλέον σβώλοι, αλλά σκόνη που αιωρείται ελεύθερα.
Εάν από διάφορες παρτίδες silica gel ληφθούν χρωματογραφήματα με
αλληλεπικαλυπτόμενες κορυφές, η επεξεργασία της πρέπει να γίνει κατά
τον ανωτέρω περιγραφόμενο τρόπο. Μια άλλη λύση θα ήταν να χρησι-
μοποιηθεί silica gel 60 εξαιρετικής καθαρότητας (αριθ. αναφ. Merck
7754).
5.6. Μητρικό διάλυμα (200 ppm) χολησταδιενί-3,5-ου (Sigma, καθαρότητας
99 %) σε εξάνιο (10 mg σε 50 ml).
5.7. Πρότυπο διάλυμα (συγκεντρώσεως 20 ppm) χολησταδιενί-3,5-ου σε εξά-
νιο, λαμβανόμενο με αραίωση του ανωτέρω διαλύματος.
Σημείωση 5.
Διατηρούμενα σε θερμοκρασία κατώτερη των 4 °C, τα διαλύματα των
σημείων 5.6 και 5.7 μπορούν να παραμείνουν αναλλοίωτα επί τέσσερις
τουλάχιστον μήνες.
5.8. Διάλυμα n-εικοσιεννεανενίου σε εξάνιο συγκεντρώσεως περίπου
100 ppm.
5.9. Φέρον αέριο για χρωματογραφία: ήλιο ή υδρογόνο καθαρότητας
99,9990 %.
5.10. Βοηθητικά αέρια για ανιχνευτή ιονισμού διά φλογός: υδρογόνο καθαρό-
τητα 99,9990 % και καθαρισμένος αέρας.
6. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
6.1. Προετοιμασία των ασαπωνοποίητων υλών:
6.1.1. Ζυγίζονται 20 ± 0,1 g ελαίου μέσα σε φιάλη των 250 ml (σημείο 4.1),
προστίθεται 1 ml πρότυπου διαλύματος χολησταδιενί-3,5-ου (20mg) και
75 ml αλκοολικού διαλύματος ποτάσας 10 %, συναρμολογείται ο ψυκτή-
ρας αναρροής και ακολουθεί θέρμανση μέχρι ελαφρού βρασμού επί 30
λεπτά. Απομακρύνεται η φιάλη που περιέχει το δείγμα από τη θερμότητα
και το διάλυμα αφήνεται να ψυχθεί ελαφρά (το διάλυμα δεν αφήνεται να
ψυχθεί εντελώς γιατί τότε το δείγμα θα στερεοποιηθεί). Προστίθενται
100 ml ύδατος και το διάλυμα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη
(σημείο 4.2) με τη βοήθεια 100 ml εξανίου. Το μείγμα ανακινείται ζωη-
ρώς επί 30 δευτερόλεπτα και αφήνεται να ηρεμήσει μέχρι να σχηματι-
σθούν οι στιβάδες.
▼M11
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 94
Σημείωση 6.
Εάν σχηματισθεί γαλάκτωμα το οποίο διατηρείται, προστίθενται μικρές
ποσότητες αιθανόλης.
6.1.2. Η υποκείμενη υδατική φάση μεταφέρεται σε δεύτερη διαχωριστική χοάνη
και εκχυλίζεται εκ νέου με 100 ml εξανίου. Αφήνεται να εκρεύσει για μια
ακόμη φορά η κατώτερη φάση και εκπλύνονται τα εκχυλίσματα εξανίου
(συνδυαζόμενα σε μια άλλη διαχωριστική χοάνη) τρεις φορές με 100 ml
μείγματος αιθανόλης-ύδατος (1: 1) κάθε φορά, μέχρις ότου επιτευχθεί
ουδέτερο pH.
6.1.3. Το διάλυμα εξανίου διαβιβάζεται μέσω άνυδρου θειικού νατρίου (50 g),
εκπλύνεται με 20 ml εξανίου και εξατμίζεται μέχρι ξηράνσεως μέσα σε
περιστροφικό εξατμιστήρα σε θερμοκρασία 30 °C και υπό χαμηλή πίεση.
6.2. Διαχωρισμός του κλάσματος στεροειδών υδρογονανθράκων:
6.2.1. Το υπόλειμμα φέρεται στην κλασματική στήλη με τη βοήθεια δύο δόσεων
εξανίου του 1 ml η καθεμία, αφήνεται το δείγμα να εκρεύσει επί της
στήλης με ταπείνωση της στάθμης του διαλύματος μέχρι της ανωτάτης
στάθμης του θειικού νατρίου και αρχίζει η χρωματογραφική έκλουση με
εξάνιο με ταχύτητα ροής ίση προς 1 ml/min περίπου. Απορρίπτονται τα
πρώτα 25-30 ml του εκλούσματος και συλλέγονται τα επόμενα 40 ml. Το
κλάσμα αυτό μεταγγίζεται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml.
Σημείωση 7.
Το πρώτο κλάσμα περιέχει κορεσμένους υδρογονάνθρακες (σχήμα 1α) και
το δεύτερο κλάσμα περιέχει τους στεροειδείς. Με περαιτέρω έκλουση
λαμβάνεται ο υδρογονάνθρακας squalene και συνεχείς ενώσεις. Για να
επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισμός μεταξύ κορεσμένων και στεροει-
δών υδρογονανθράκων, οι όγκοι των κλασμάτων πρέπει να είναι οι
καταλληλότεροι δυνατοί. Προς τούτο, ο όγκος του πρώτου κλάσματος
πρέπει να προσαρμόζεται κατά τρόπον ώστε, κατά την ανάλυση του δεύ-
τερου κλάσματος, οι κορυφές που αντιστοιχούν στους κορεσμένους υδρο-
γονάνθρακες να είναι χαμηλές (βλέπε σχήμα 1γ)· αν δεν εμφανισθούν,
αλλά η ένταση της κορυφής του πρότυπου διαλύματος είναι χαμηλή, τότε
ο όγκος πρέπει να ελαττώνεται. Πάντως, δεν χρειάζεται να γίνεται πλήρης
διαχωρισμός μεταξύ των συστατικών του πρώτου και του δεύτερου κλά-
σματος, αφού κατά την ανάλυση με αέριο χρωματογραφία δεν γίνεται
αλληλεπικάλυψη κορυφών, εφόσον έχουν τηρηθεί οι συνθήκες αερίου
χρωματογραφίας που αναφέρονται στο σημείο 6.3.1. Ούτε χρειάζεται
κατά κανόνα να επιτυγχάνεται ο κατλληλότερος όγκος του δεύτερου κλά-
σματος, αφού με τα περαιτέρω συστατικά γίνεται ικανοποιητικός διαχω-
ρισμός. Παρ' όλα αυτά, μια υψηλή κορυφή που σημειώνεται σε χρόνο
κατακράτησης χαμηλότερο κατά 1,5 min περίπου από τον αντίστοιχο του
πρότυπου διαλύματος οφείλεται στον υδρογονάνθρακα squalene και είναι
ενδεικτική μη ικανοποιητικού διαχωρισμού.
6.2.2. Το δεύτερο κλάσμα εξατμίζεται μέχρι ξηράνσεως μέσα σε εξατμιστήρα σε
θερμοκρασία 30 °C και υπό χαμηλή πίεση, και αμέσως, μετά διαλύεται το
υπόλειμμα σε 0,2 ml εξανίου. Το διάλυμα φυλάσσεται στο ψυγείο μέχρις
ότου αναλυθεί.
Σημείωση 8.
Τα υπολείμματα των σημείων 6.1.3 και 6.2.2 δεν πρέπει να παραμένουν
ξηρά και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μόλις ληφθούν, πρέπει να προ-
στίθεται ο διαλύτης και εν συνεχεία να φυλάσσονται στο ψυγείο.
6.3. Αέριος χρωματογραφία:
6.3.1. Συνθήκες εργασίας για διάταξη έγχυσης split:
— Θερμοκρασία στη διάταξη έγχυσης: 300 °C.
— Θερμοκρασία ανιχνευτή: 320 °C.
— Καταγραφέας-ολοκληρωτής: οι παράμετροι ολοκλήρωσης πρέπει να
καθορίζονται κατά τρόπον ώστε ο υπολογισμός των εμβαδών να
είναι ακριβής. Συνιστάται η ολοκλήρωση κοιλάδα προς κοιλάδα.
— Ευαισθησία: το δεκαεξαπλάσιο περίπου της ελάχιστης εξασθένησης.
— όγκος εγχεόμενου διαλύματος: 1ml.
▼M11
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 95
— Θερμοκρασίες προγραμματισμού του κλιβάνου: αρχικά 235 °C επί
6 min και εν συνεχεία αύξηση κατά 2 °C/min μέχρι θερμοκρασίας
285 °C.
— Έγχυση με μερισμό ροής: 1: 15.
— Φέρον αέριο: ήλιο ή υδρογόνο υπό πίεση 120 kPa περίπου.
Οι συνθήκες αυτές μπορούν να προσαρμόζονται ανάλογα με τα χαρακτη-
ριστικά του χρωματογράφου και της στήλης, κατά τρόπον ώστε τα λαμ-
βανόμενα χρωματογραφήματα να πληρούν τους ακόλουθους όρους: ο
χρόνος κατακράτησης του διαλύματος εσωτερικού προτύπου θα αντιστοι-
χεί προς τους χρόνους που εμφαίνονται στο σημείο 6.3.2 με ακρίβεια
± 5 min· η κορυφή του διαλύματος εσωτερικού προτύπου θα αντιστοιχεί
προς το 80 % τουλάχιστον της πλήρους κλίμακας.
Το σύστημα αέριας χρωματογραφίας πρέπει να ελέγχεται με έγχυση μείγ-
ματος από το μητρικό διάλυμα χολησταδιενίου (σημείο 5.6) και το διά-
λυμα n-εικοσιεννεανίου (σημείο 5.8). Η κορυφή που αντιστοιχεί στο
χολησταδιέν-3,5-ιο πρέπει να εμφανίζεται πριν από την κορυφή που αντι-
στοιχεί στο n-εικοσιεννεάνιο (σχήμα 1γ)· εάν αυτό δεν συμβεί, υπάρχουν
δύο λύσεις: να μειωθεί η αρχική θερμοκρασία του κλιβάνου ή/και να
χρησιμοποιηθεί στήλη αερίου χρωματογραφίας μικρότερης πολικότητας.
6.3.2. Ταυτοποίηση των κορυφών του φάσματος.
Η κορυφή του διαλύματος εσωτερικού προτύπου εμφανίζεται στα 19 min
περίπου και το στιγμασταδιέν-3,5-ιο σε σχετικό χρόνο κατακράτησης ίσο
προς 1,29 (βλέπε σχήμα 1β). Το στιγμασταδιέν-3,5-ιο συνοδεύεται από
μικρές ποσότητες ισομερούς και, συνήθως, εμφανίζονται και τα δύο ως
μία κορυφή χρωματογραφήματος. Παρόλα αυτά, εάν η στήλη είναι πολύ
πολική ή έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, το ισομερές μπορεί να
εμφανίζεται ως μικρή κορυφή πριν και πολύ κοντά στην κορυφή του
στιγμασταδιεν-3,5-ίου (σχήμα 2). Για να εξασφαλιστεί η έκλουση των
στιγμασταδιενίων σε μία κορυφή συνιστάται η αντικατάσταση της στήλης
με άλλη μικρότερης πολικότητας ή μεγαλύτερης εσωτερικής διαμέτρου.
Σημείωση 9.
Στιγμασταδιένια αναφοράς μπορούν να ληφθούν από την ανάλυση ενός
εξευγενισμένου φυτικού ελαίου με τη χρησιμοποίηση μικρότερης ποσό-
τητας δείγματος (1-2 g). Τα στιγμασταδιένια εμφανίζονται ως ευμεγέθης
κορυφή που ταυτοποιείται εύκολα.
6.3.3. Ποσοτικός προσδιορισμός
Η περιεκτιότητα σε στιγμασταδένιο προσδιορίζεται βάσει του τύπου:
στιγμασταδένια (mg/kg):
As � Mc;
Ac � Mo
όπου: Ab = εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο στιγμαστα-
δένιο (εάν η κορυφή αυτή χωρίζεται σε δύο, άθροισμα
των εμβαδών που αντιστοιχούν στα δύο ισομερή)
Ac = εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου (χολη-
σταδένιο)
Mc = μάζα (σε mg) του προστιθέμενου προτύπου
Mo = μάζα (σε g) του δείγματος ελαίου.
Το όριο ανίχνευσης κυμαίνεται γύρω από την τιμή 0,01 mg/kg.
▼M11
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 96
Σχήμα 1
Χρωματογραφήματα αερίου ληφθέντα από δείγματα ελαιολάδου που αναλύθη-
καν σε τριχοειδή στήλη (εσωτερικής διαμέτρου 0,25 mm και μήκους 25 m) από
τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, επιχρισμένη με 5 %- φαινυλομεθυλοσιλικόνη
πάχους 0,25 mm.
▼M11
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 97
α) Πρώτο κλάσμα (30 ml) από παρθένο ελαιόλαδο, ενισχυμένο με το πρότυπο
διάλυμα.
β) Δεύτερο κλάσμα (40 ml) από ελαιόλαδο που περιέχει στιγμασταδιένια σε
αναλογία 0,10 mg/kg.
γ) Δεύτερο κλάσμα (40 ml) που περιέχει μικρό ποσοστό του πρώτου κλάσματος.
Σχήμα 2
Χρωματογράφημα αερίου από δείγμα εξευγενισμένου ελαιολάδου που αναλύεται
στη στήλη DB-5, το οποίο δείχνει το ισομερές του στιγμασταδιεν-3,5-ίου.
▼M11
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 98
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVIII
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙΔΙΩΝ ΜΕ ECN42 (ΔΙΑΦΟΡΑ
ΜΕΤΑΞΥ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ HPLC ΚΑΙ ΘΕΩΡΗΤΙΚΗΣ
ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ)
1. Αντικείμενο
Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας των τριγλυκεριδίων (TAG) στα
ελαιόλαδα με τη βοήθεια του ισοδύναμου αριθμού άνθρακα από τις
διαφορές μεταξύ των αναλυτικών αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με
υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και της θεωρητικής
τιμής περιεκτικότητας, που υπολογίζεται αρχίζοντας από τη σύνθεση
των λιπαρών ουσιών.
2. Πεδίο εφαρμογής
Το πρότυπο αυτό εφαρμόζεται στα ελαιόλαδα. Η μέθοδος ισχύει για την
ανίχνευση της παρουσίας μικρών ποσοτήτων σπορέλαιων (πλούσιων σε
λινελαϊκό οξύ) σε κάθε κατηγορία ελαιόλαδων.
3. Αρχή
Στο αυθεντικό ελαιόλαδο, η θεωρητική τιμή της περιεκτικότητας των
τριγλυκεριδίων με ECN42 [υπολογιζόμενη με βάση τον προσδιορισμό
της σύνθεσης των λιπαρών οξέων με αέρια χρωματογραφία (GLC)] αντι-
στοιχεί, εντός ορισμένων ορίων με την περιεκτικότητα των τριγλυκερι-
δίων που προσδιορίζεται με ανάλυση με ECN42. Διαφορές μεγαλύτερες
των τιμών που ορίζονται στον κανονισμό για κάθε τύπο ελαιολάδου
καταδεικνύουν ότι το λάδι περιέχει σπορέλαια.
4. Μέθοδος
Η μέθοδος για τον υπολογισμό της θεωρητικής τιμής της περιεκτικότη-
τας των τριγλυκεριδίων με ECN42 καθώς και η διαφορά της από την
τιμή που λαμβάνεται από την ανάλυση HPLC υπολογίζονται μέσω
άλλων μεθόδων. Διακρίνονται τρεις φάσεις: προσδιορισμός της σύνθεσης
των λιπαρών οξέων με αέρια χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης, υπο-
λογισμός θεωρητικής σύνθεσης τριγλυκεριδίων με ECN42, προσδιορι-
σμός τριγλυκεριδίων με ECN42 με HPLC.
4.1. Όργανα
4.1.1. Σφαιρικές φιάλες των 250 και 500 ml.
4.1.2. Ποτήρια ζέσεως των 100 ml.
4.1.3. Γυάλινη στήλη χρωματογραφίας, εσωτερικής διαμέτρου 21 mm, μήκους
450 mm, εφοδιασμένη με στρόφιγγα και με εσμυρισμένη κωνική υπο-
δοχή στην κορυφή της.
4.1.4. Διαχωριστική χοάνη των 250 ml με αρσενικό κωνικό εσμύρισμα κατάλ-
ληλο για να προσαρμοστεί στην κορυφή της στήλης.
4.1.5. Γυάλινη ράβδος μήκους 600 mm.
4.1.6. Γυάλινη χοάνη διαμέτρου 80 mm.
4.1.7. Ογκομετρικές φιάλες των 50 ml.
4.1.8. Ογκομετρικές φιάλες των 20 ml.
4.1.9. Περιστροφικός εξατμιστής.
4.1.10. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης που επιτρέπει τον θερμοστατικό
έλεγχο της θερμοκρασίας της στήλης.
4.1.11. Βρόγχος εισόδου των 10 μl.
4.1.12. Ανιχνευτής: διαφορετικό διαθλασίμετρο. Η ευαισθησία πλήρους κλίμα-
κας πρέπει να είναι τουλάχιστον 10-4 μονάδες δείκτη διάθλασης.
4.1.13. Στήλη: σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα μήκους 250 mm και εσωτερι-
κής διαμέτρου 4,5 mm· πληρωμένη με σωματίδια διοξειδίου του πυρι-
τίου με 22-23 % άνθρακα σε μορφή δεκαοκτυλοσιλανίου, διαμέτρου
5 μm (σημείωση 2).
4.1.14. Καταγραφέας ή/και ολοκληρωτής.
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 99
4.2. Αντιδραστήρια
Τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητας. Οι διαλύτες
έκλουσης πρέπει να είναι απαερωμένοι, και να μπορούν να ανακυκλω-
θούν αρκετές φορές χωρίς επίδραση στους διαχωρισμούς.
4.2.1. Πετρελαϊκός αιθέρας, σ.ζ. 40-60 °C, για χρωματογραφία·
4.2.2. Αποσταγμένος αιθυλαιθέρας, απαλλαγμένος υπεροξειδίων.
4.2.3. Διαλύτης έκλουσης για χρωματογραφία στήλης: μείγμα πετελαϊκού αιθέ-
ρα/αιθυλαιθέρα 87/13 (v/v).
4.2.4. Πηκτή διοξειδίου του πυριτίου (Silica gel), 70-230 mesh, 7734 Merck,
σταθερής περιεκτικότητας σε νερό 5 % (w/w).
4.2.5. Υαλοβάμβακας.
4.2.6. Ακετόνη.
4.2.7. Ακετονιτρίλιο.
4.2.8. Διαλύτης έκλουσης HPLC: ακετονιτρίλιο + ακετόνη (οι αναλογίες ρυθ-
μίζονται ώστε να επιτευχθεί ο επιθυμητός διαχωρισμός· αναλογία εκκί-
νησης 50:50).
4.2.9. Διαλύτης διαλυτοποίησης: ακετόνη ή μείγμα ακετόνης-χλωροφόρμιου σε
αναλογία 1:1.
4.2.10. Τριγλυκερίδια αναφοράς: μπορούν αν χρησιμοποιηθούν είτε τριγλυκερί-
δια του εμπορίου (τριπλαμιτίνη, τριελαΐνη κ.λπ.) και να σχεδιαστεί
καμπύλη των χρόνων κατακράτησης συναρτήσει του ισοδύναμου αριθ-
μού άνθρακα ή εναλλακτικά, χρωματογραφήματα αναφοράς από μείγμα
σογιέλαιου-αυθεντικού ελαιόλαδου σε αναλογία 30:70 (βλέπε σημειώ-
σεις 3 και 4 και σχήματα 1, 2, 3 και 4).
4.3. Προετοιμασία δείγματος
Δεδομένου ότι η παρεμβολή ορισμένων ουσιών μπορεί να οδηγήσει σε
λανθασμένο θετικό αποτέλεσμα, το δείγμα πρέπει πάντα να καθαρίζεται
σύμφωνα με τη μέθοδο IUPAC 2.507, που χρησιμοποιείται για τον
προσδιορισμό των πολικών συστατικών σε οξειδωμένα έλαια.
4.3.1. Π α ρ α σ κ ε υ ή τ η ς χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ι κ ή ς σ τ ή λ η ς
Η στήλη (4.1.3) πληρούνται με 30 ml περίπου διαλύτη έκλουσης (4.2.3)·
εισάγεται βύσμα υαλομβάμβακα (4.2.5), που σπρώχνεται με τη γυάλινη
ράβδο (4.1.5) μέχρι το άκρο της στήλης.
Μέσα σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml, παρασκευάζεται αιώρημα 25 g
πηκτής διοξειδίου (4.2.4) μέσα σε 80 ml μείγματος έκλουσης (4.2.3)
και μεταγγίζεται στη στήλη με τη βοήθεια χωνίου (4.1.6).
Για να διασφαλιστεί ότι έχει μεταφερθεί όλο το πυριτικό οξύ στη στήλη,
το ποτήρι ζέσεως εκπλένεται με το μείγμα έκλουσης και το υγρό της
πλύσης μεταφέρεται και αυτό εντός της στήλης.
Η στρόφιγγα της στήλης ανοίγεται και το διάλυμα εκρέει έως ότου η
στάθμη του διαλύτη έκλουσης βρίσκεται 1 cm πάνω από το silica gel.
4.3.2. Χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ί α σ τ ή λ η ς
Σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml (4.1.7) ζυγίζονται 2,5 ± 0,1 g με
ακρίβεια 0,001 γ. διαθημένου, ομογενοποιημένου και, αν κρίνεται ανα-
γκαίο, αφυδατομένου λαδιού, και διαλύονται σε 20 ml περίπου διαλύτη
έκλουσης (4.2.3). Αν θεωρείται απαραίτητο, το σύνολο θερμαίνεται ελα-
φρά για να διευκολυνθεί η διάλυση, στη συνέχεια το διάλυμα ψύχεται σε
θερμοκρασία περιβάλλοντος και, τέλος, συμπληρώνεται ο όγκος του με
διαλύτη έκλουσης.
Με τη βοήθεια βαθμολογημένου σιφονιού, προστίθενται στη στήλη
20 ml διαλύματος, όπως παρασκευάστηκε στο σημείο (4.3.1). Η στρό-
φιγγα ανοίγεται και ο διαλύτης εκρέει, έως ότου η στάθμη του εξισωθεί
με τη στάθμη του silica gel.
Εν συνεχεία, εκλούονται 150 ml διαλύτη έκλουσης (4.2.3), η δε παροχή
ρυθμίζεται σε 2 ml/min (κατά τρόπο ώστε τα 150 ml να εκρεύσουν από
τη στήλη σε 60-70 λεπτά).
Το έκλουσμα συλλέγεται σε σφαιρική φιάλη (4.1.1) των 250 ml, που
έχει προηγουμένως ξηρανθεί μέχρι σταθερού βάρους και ζυγιστεί με
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 100
ακρίβεια. Ο διαλύτης απομακρύνεται υπό ελαττωμένη πίεση (Rotavapor)
και ζυγίζεται το υπόλειμμα το οποίο θα χρησιμοποιηθεί για την παρα-
σκευή του διαλύματος για την ανάλυση HPLC και την παρασκευή των
μεθυλεστέρων.
Η ανάκτηση του δείγματος από τη στήλη πρέπει να είναι κατά 90 %
τουλάχιστον για τις κατηγορίες εξαιρετικό παρθένο, παρθένο, κοινό
εξευγενισμένο και ελαιόλαδο και τουλάχιστον 80 % για το μειονεκτικό
παρθένο ελαιόλαδο και τα πυρηνέλαια.
4.4. Ανάλυση HPLC
4.4.1. Π ρ ο ε τ ο ι μ α σ ί α τ ω ν δ ε ι γ μ ά τ ω ν γ ι α χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ι κ ή
α ν ά λ υ σ η
Σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, παρασκευάζεται διάλυμα 5 % του
δείγματος προς ανάλυση δια ζυγίσεως 0,5 ± 0,001 g του δείγματος
και συμπλήρωση του όγκου με το διαλύτη διαλυτοποίησης μέχρι τα
10 ml (4.2.9).
4.4.2. Τ ρ ό π ο ς ε ρ γ α σ ί α ς
Το χρωματογραφικό σύστημα τίθεται σε λειτουργία. Ο διαλύτης έκλου-
σης (4.2.8) αντλείται με παροχή 1,5 ml/min για να καθαριστεί ολόκληρο
το σύστημα. Αφήνεται έως ότου ληφθεί μία σταθερή γραμμή βάσης.
Εγχέονται 10 μl του δείγματος, όπως αυτό παρασκευάστηκε στο 4.3.
4.4.3. Υ π ο λ ο γ ι σ μ ό ς κ α ι έ κ φ ρ α σ η τ ω ν α π ο τ ε λ ε σ μ ά τ ω ν
Χρησιμοποιείται η μέθοδος κανονικοποίησης, δηλαδή υποτίθεται ότι το
άθροισμα των εμβαδών των κορυφών που αντιστοιχούν στα τριγλυκερί-
δια από ECN 42 έως ECN 52 ισούται με 100 %. Η σχετική εκατοστιαία
αναλογία κάθε τριγλυκεριδίου υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο:
ποσοστό επί % τριγλυκερίδιου = εμβαδόν κορυφής × 100 / άθροισμα
εμβαδών κορυφών,
Τα αποτελέσματα πρέπει να περιέχουν τουλάχιστον δύο δεκαδικά ψηφία.
Σημείωση 1: Η σειρά έκλουσης μπορεί να προσδιοριστεί υπολογίζονταςς
τους ισοδύναμους αριθμούς άνθρακα, συχνά καθοριζόμενους από τη
σχέση ECN = CN-2n, όπου CN είναι ο αριθμός άνθρακα και n ο αριθ-
μός των διπλών δεσμών. Μπορεί, όμως, να υπολογιστεί με μεγαλύτερη
ακρίβεια λαμβάνοντας υπόψη την προέλευση των διπλών δεσμών. Εάν
no, nl και nln είναι οι αριθμοί των διπλών δεσμών που αποδίδονται στό
ελαϊκό, λινελαϊκό και λινολενικό οξύ αντίστοιχα, ο ισοδύναμος αριθμός
άνθρακα μπορεί να υπολογιστεί από μία σχέση της μορφής::
ECN = CN - dono - dlnl - dlnnln,
όπου οι συντελεστές do, dl και dln μπορούν να υπολογιστούν με χρήση
των τριγλυκεριδίων αναφοράς. Στις συνθήκες που καθορίζονται σε αυτή
τη μέθοδο, η σχέση που λαμβάνεται είναι περίπου:
ECN = CN - (2,60 no) - (2,35 nl) - (2,17 nln)
Σημείωση 2: Παραδείγματα: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere ή αντίστοιχο (Merck) 100 CH18 Art 50377.
Σημείωση 3: Με αρκετά τριγλυκερίδια αναφοράς είναι επίσης δυνατό να
υπολογιστεί η διακριτική ικανότητα αναφορικά με την τριελαΐνη,
α = RT′ = RT′ τριελαΐνης
χρησιμοποιώντας τον ανηγμένο χρόνο κατακράτησης RT′ = RT′ - RT
διαλύτη
Η καμπύλη τιμών του logα συναρτήσει του f (αριθμός διπλών δεσμών)
επιτρέπει τον προσδιορισμό των τιμών του χρόνου κατακράτησης για
όλα τα τριγλυκερίδια των λιπαρών οξέων που περιέχονται στα τριγλυ-
κερίδια αναφοράς (βλέπε σχήμα 2).
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 101
Σημείωση 4: Η αποτελεσματικότητα της στήλης πρέπει να επιτρέπει
σαφή διαχωρισμό της κορυφής της τριλινελαΐνης από τις κορυφές των
τριγλυκεριδίων με παραπλήσιο RT. Η έκλουση πραγματοποιείται μέχρι
την κορυφή ECN 52.
Σημείωση 5: Για να διασφαλιστεί η ορθή μέτρηση των εμβαδών όλων
των κορυφών, πρέπει η δεύτερη κορυφή που αντιστοιχεί στο ECN 50 να
είναι το 50 % της πλήρους κλίμακος του καταγραφέα.
4.5. Υπολογισμός της σύστασης των τριγλυκεριδίων
4.5.1. Π ρ ο σ δ ι ο ρ ι σ μ ό ς τ η ς σ ύ σ τ α σ η ς λ ι π α ρ ώ ν ο ξ έ ω ν
Η σύσταση των λιπαρών οξέων προσδιορίζεται με βάση τη μέθοδο
αέριας χρωματογραφίας (ΕΟΚ), η οποία αναφέρεται στο παράρτημα Χ
κεφάλαιο Α του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91, και κατά την οποία
χρησιμοποιείται τριχοειδής στήλη. Η παρασκευή των μεθυλεστέρων
πραγματοποιείται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο παράρ-
τημα Χ κεφάλαιο Β (αντίδραση με μεθυλικό νάτριο σε διάλυμα ακλοό-
λης) του ίδιου κανονισμού.
4.5.2. Λ ι π α ρ ά ο ξ έ α π ο υ λ α μ β ά ν ο ν τ α ι υ π ό ψ η κ α τ ά τ ο υ ς
υ π ο λ ο γ ι σ μ ο ύ ς
Τα γλυκερίδια κατατάσσονται σε κατηγορίες ανάλογα με τους ισοδύνα-
μους αριθμούς άνθρακα (ECN), λαμβάνοντας υπόψη τους ακόλουθες
ισοδυναμίες μεταξύ του ECN και των λιπαρών οξέων. Λήφθηκαν
υπόψη μόνο τα λιπαρά οξέα με 16 ή 18 άτομα άνθρακα διότι μόνο
αυτά έχουν σημασία στην περίπτωση του ελαιόλαδου.
Λιπαρό οξύ (ΛΟ)
Συντομογρα-
φία
Μοριακό
βάρος (ΜΒ)
ECN
Παλμιτικό οξύ P 256,4 16
Παλμιτελαϊκό οξύ Po 254,4 14
Στεατικό οξύ S 284,5 18
Ελαϊκό οξύ O 282,5 16
Λινελαϊκό οξύ L 280,4 14
Λινολενικό οξύ Ln 278,4 12
4.5.3. Μ ε τ α τ ρ ο π ή τ ο υ π ο σ ο σ τ ο ύ % τ ο υ ε μ β α δ ο ύ σ ε m o l e s
γ ι α ό λ α τ α λ ι π α ρ ά ο ξ έ α
moles P ¼ % εμβαδ: P
PM P
moles S ¼ % εμβαδ: S
PM S
moles Po ¼ % εμβαδ: Po
PM Po
(1)
moles O ¼ % εμβαδ: O
PM O
moles L ¼ % εμβαδ: L
PM L
moles Ln ¼ % εμβαδ: Ln
PM Ln
9>>=
>>;
4.5.4. Κ α ν ο ν ι κ ο π ο ί η σ η τ ω ν m o l e s λ ι π α ρ ώ ν ο ξ έ ω ν σ ε 1 0 0 %
% moles Pð1; 2; 3Þ ¼ moles P � 100
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ
(2)
% moles Sð1; 2; 3Þ ¼ moles S � 100
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ
% moles Po ð1; 2; 3Þ ¼ moles Po � 100
moles ð P þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ
% moles O ð1; 2; 3Þ ¼ moles O � 100
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ
% moles L ð1; 2; 3Þ ¼ moles L � 100
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ
% moles Ln ð1; 2; 3Þ ¼ moles Ln � 100
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ
9>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>;
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 102
Το αποτέλεσμα δίνει την εκατοστιαία αναλογία κάθε λιπαρού οξέως σε
% moles στο σύνολο των θέσεων 1,2,3-των TAG.
Στη συνέχεια, υπολογίζεται το άθροισμα των κεκορεσμένων λιπαρών
οξέων P και S (SFA) καθώς και των ακόρεστων λιπαρών οξέων Po,
O, L και Ln (UFA):
% moles SFA = % moles P + % moles S
(3)
% moles UFA = 100 - % moles AGS.
)
4.5.5. Υ π ο λ ο γ ι σ μ ό ς τ η ς σ ύ ν θ ε σ η ς τ ω ν T AG σ ε λ ι π α ρ ά ο ξ έ α
σ τ ι ς θ έ σ ε ι ς 2 - κ α ι 1 , 3 -
Τα λιπαρά οξέα κατανέμονται σε τρία σύνολα κατά τον ακόλουθο
τρόπο: δύο πανομοιότυπα για τις θέσεις 1- και 3- και ένα για τη θέση
2-, με διαφορετικούς συντελεστές για τα κεκορεσμένα οξέα (P και S) και
για τα ακόρεστα (Po, O, L και Ln).
4.5.5.1. Κεκορεσμένα λιπαρά οξέα στη θέση 2- [P(2) και S(2)]
% moles P(2) = % moles P (1,2,3) * 0,06
(4)
% moles S(2) = % moles S (1,2,3) * 0,06
)
4.5.5.2. Ακόρεστα λιπαρά οξέα στη θέση 2- [Po(2), O(2), L(2) και Ln(2)]:
% moles Po ð2Þ ¼ % moles Po ð1; 2; 3Þ
% moles AGI
� ½100 � % moles Pð2Þ � % moles Sð2Þ�
(5)
% moles Oð2Þ ¼ % moles Oð1; 2; 3Þ
% moles AGI
� ½100 � % moles Pð2Þ � % moles Sð2Þ�
% moles Lð2Þ ¼ % moles Lð1; 2; 3Þ
% moles AGI
� ½100 � % moles Pð2Þ � % moles Sð2Þ�
% moles Lnð2Þ ¼ % moles Lnð1; 2; 3Þ
% moles AGI
� ½100 � % moles Pð2Þ � % moles Sð2Þ�
9>>>>>>>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>>>>>>>;
4.5.5.3. Λιπαρά οξέα στις θέσεις 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) και
Ln(1,3)]
% moles Pð1; 3Þ ¼ % moles Pð1; 2; 3Þ � % moles Pð2Þ
þ % moles Pð1; 2; 3Þ
(6)
% moles Sð1; 3Þ ¼ % moles Sð1; 2; 3Þ � % moles Sð2Þ
þ % moles Sð1; 2; 3Þ
% moles Poð1; 3Þ ¼ % moles Poð1; 2; 3Þ � % moles Poð2Þ
þ % moles Poð1; 2; 3Þ
% moles Oð1; 3Þ ¼ % moles Oð1; 2; 3Þ � % moles Oð2Þ
þ % moles Oð1; 2; 3Þ
% moles Lð1; 3Þ ¼ % moles Lð1; 2; 3Þ � % moles Lð2Þ
þ % moles Lð1; 2; 3Þ
% moles Lnð1; 3Þ ¼ % moles Lnð1; 2; 3Þ � % moles Lnð2Þ
þ % moles Lnð1; 2; 3Þ
9>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>;
4.5.6. Υ π ο λ ο γ ι σ μ ό ς τ ω ν τ ρ ι γ λ υ κ ε ρ ι δ ί ω ν
4.5.6.1. TAG με ένα μόνο λιπαρό οξύ (AΑΑ· εν προκειμένω LLL, PoPoPo)
% moles AAA ¼ % moles Að1; 3Þ � % moles Að2Þ � % moles A ð1; 3Þ
(7)
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 103
4.5.6.2. TAG με δύο λιπαρά οξέα (AΑΒ· εν προκειμένω PoPoL, PoLL)
% moles AAB ¼ % moles Að1; 3Þ � % moles Að2Þ � % moles Bð1; 3Þ � 2
(8)
% moles ABA ¼ % moles Að1; 3Þ � % moles Bð2Þ � % moles Að1; 3Þ
9>>>=
>>>;
4.5.6.3. TAG με τρία διαφορετικά λιπαρά οξέα (ABC· εν προκειμένω OLLn,
PLLn, PoOLn, PPoLn)
% moles ABC ¼ % moles Að1; 3Þ � % moles Bð2Þ � % moles Cð1; 3Þ � 2
(9)% moles BCA ¼ % moles Bð1; 3Þ � % moles Cð2Þ � % moles Að1; 3Þ � 2
%moles CAB ¼ % moles Cð1; 3Þ � % moles Að2Þ � % moles Bð1; 3Þ � 2
9>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>;
4.5.6.4. Τριγλυκερίδια με ECN42
Τα ακόλουθα τριγλυκερίδια με ECN42 υπολογίζονται βάσει των εξισώ-
σεων 7, 8 και 9, ανάλογα με τη σειρά της αναμενόμενης έκλουσης στην
HPLC (κανονικά μόνο τρεις κορυφές).
LLL
PoLL και το ισομερές θέσης LPoL
OLLn και τα ισομερή θέσης OLnL και LnOL
PoPoL και το ισομερές θέσης PoLPo
PoOLn και τα ισομερή θέσης OPoLn και OLnPo
PLLn και τα ισομερή θέσης LLnP και LnPL
PoPoPo
SLnLn και το ισομερές θέσης LnSLn
PPoLn και τα ισομερή θέσης PLnPo και PoPLn
Τα τριγλυκερίδια με ECN42 προκύπτουν από το άρθροισμα των εννέα
τριακυλογλυκερολών, συμπεριλαμβανομένων των ισομερών θέσης τους.
Τα αποτελέσματα πρέπει να περιέχουν τουλάχιστον δύο δεκαδικά ψηφία.
5. Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων
Συγκρίνεται η υπολογιζόμενη θεωρητικώς τιμή περιεκτικότητας με αυτή
που προσδιορίστηκε από την ανάλυση HPLC. Εάν η διαφορά των θεω-
ρητικών δεδομένων από τα δεδομένα της HPLC είναι μεγαλύτερη από
τις τιμές που ορίζονται για την ανάλογη κατηγορία στον κανονισμό,
αυτό σημαίνει ότι το δείγμα περιέχει σπορέλαιο.
Σημείωση: τα αποτελέσματα εκφράζονται με ακρίβεια ενός δεκαδικού
ψηφίου.
6. Παράδειγμα (οι αριθμοί αναφέρονται στα τμήματα του κειμένου της
μεθόδου)
4.5.1. Υ π ο λ ο γ ι σ μ ό ς τ ω ν % mo l e s τ ω ν λ ι π α ρ ώ ν ο ξ έ ω ν α π ό
δ ε δ ο μ έ ν α GLC (% τ ο υ ε μ β α δ ο ύ )
Τα ακόλουθα δεδομένα για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων λαμβάνονται
με αέρια χρωματογραφία:
ΛΟ
ΜΒ
P
256,4
S
284,5
Po
254,4
O
282,5
L
280,4
Ln
278,4
% του εμβ. 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 104
4.5.3. Με τ α τ ρ ο π ή τ ο υ π ο σ ο σ τ ο ύ % τ ο υ ε μ β α δ ο ύ σ ε m o l e s
γ ι α ό λ α τ α λ ι π α ρ ά ο ξ έ α
moles P ¼ 10
256; 4
¼ 0; 03900 moles P Βλέπε τύπο (1)
moles S ¼ 3
284; 5
¼ 0; 01054 moles S Βλέπε τύπο (1)
moles Po ¼ 1
254; 4
¼ 0; 00393 moles Po Βλέπε τύπο (1)
moles O ¼ 75
282; 5
¼ 0; 26549 moles O Βλέπε τύπο (1)
moles L ¼ 10
280; 4
¼ 0; 03566 moles L Βλέπε τύπο (1)
moles Ln ¼ 1
278; 4
¼ 0; 003594 moles Ln Βλέπε τύπο (1)
Άθροισμα = 0,35822 moles TG
4.5.4. Κ α ν ο ν ι κ ο π ο ί η σ η τ ω ν m o l e s λ ι π α ρ ώ ν ο ξ έ ω ν σ ε 1 0 0 %
% moles Pð1; 2; 3Þ ¼ 0; 03900 moles P � 100
0; 35822 moles
¼ 10; 888 % Βλέπε τύπο (2)
% moles Sð1; 2; 3Þ ¼ 0; 01054 moles S � 100
0; 35822 moles
¼ 2; 944 % Βλέπε τύπο (2)
% moles Poð1; 2; 3Þ ¼ 0; 00393 moles Po � 100
0; 35822 moles
¼ 1; 097 % Βλέπε τύπο (2)
% moles Oð1; 2; 3Þ ¼ 0; 26549 moles O � 100
0; 35822 moles
¼ 74; 113 % Βλέπε τύπο (2)
% moles Lð1; 2; 3Þ ¼ 0; 03566 moles L � 100
0; 35822 moles
¼ 9; 956 % Βλέπε τύπο (2)
% moles Lnð1; 2; 3Þ ¼ 0; 00359 moles Ln � 100
0; 35822 moles
¼ 1; 003 % Βλέπε τύπο (2)
Συνολικά % moles = 100,0 %
Άθροισμα των κεκορεσμένων και των ακόρεστων λιπαρών οξέων στις
θέσεις 1,2,3- των TAG:
% moles AGS = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Βλέπε τύπο (3)
% moles AGI = 100,000 % - 13,831 % = 86,169 % Βλέπε τύπο (3)
4.5.5. Υ π ο λ ο γ ι σ μ ό ς τ η ς σ ύ ν θ ε σ η ς τ ω ν T AG σ ε λ ι π α ρ ά ο ξ έ α
σ τ ι ς θ έ σ ε ι ς 2 - κ α ι 1 , 3 -
4.5.5.1. Κεκορεσμένα οξέα στη θέση 2- [P(2) και S(2)]
% moles P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % Βλέπε τύπο (4)
% moles S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % Βλέπε τύπο (4)
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 105
4.5.5.2. Ακόρεστα λιπαρά οξέα στις θέσεις 1,3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) και
Ln(1,3)]
% moles Poð2Þ ¼ 1; 097 %
86; 169 %
� ð100 � � 0; 659 � 0; 177Þ ¼ 1; 263 % moles Βλέπε τύπο (5)
% moles Oð2Þ ¼ 74; 113 %
86; 169 %
� ð100 � � 0; 659 � 0; 177Þ ¼ 85; 295 % moles Βλέπε τύπο (5)
% moles Lð2Þ ¼ 9; 956 %
86; 169 %
� ð100 � � 0; 659 � 0; 177Þ ¼ 11; 458 % moles Βλέπε τύπο (5)
% moles Lnð2Þ ¼ 1; 003 %
86; 169 %
� ð100 � � 0; 659 � 0; 177Þ ¼ 1; 154 % moles Βλέπε τύπο (5)
4.5.5.3. Λιπαρά οξέα στις θέσεις 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) και
Ln(1,3)]
% moles Pð1; 3Þ ¼ 10; 888 � 0; 659
10; 888 ¼ 16; 005 % moles Βλέπε τύπο (6)
% moles Sð1; 3Þ ¼ 2; 944 � 0; 177
2; 944 ¼ 4; 327 % moles Βλέπε τύπο (6)
% moles Poð1; 3Þ ¼ 1; 097 � 1; 263
1; 097 ¼ 1; 015 % moles Βλέπε τύπο (6)
% moles Oð1; 3Þ ¼ 74; 113 � 85; 295
74; 113 ¼ 68; 522 % moles Βλέπε τύπο (6)
% moles Lð1; 3Þ ¼ 9; 956 � 11; 458
9; 956 ¼ 9; 205 % moles Βλέπε τύπο (6)
% moles Lnð1; 3Þ ¼ 1; 003 � 1; 154
1; 003 ¼ 0; 927 % moles Βλέπε τύπο (6)
4.5.6. Υ π ο λ ο γ ι σ μ ό ς τ ω ν τ ρ ι α κ υ λ ο γ λ υ κ ε ρ ο λ ώ ν
Από την υπολογιζόμενη περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα στη θέση 2- και
στις θέσεις 1,3- (βλέπε παραπάνω):
ΛΟ σε Θέσεις 1,3- Θέση 2-
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %
L 9,205 % 11,458 %
Ln 0,927 % 1,154 %
Σύνολο 100,0 % 100,0 %
υπολογίζονται οι ακόλουθες τριακυλογλυκερόλες:
LLL
PoPoPo
PoLL με 1 ισομερές θέσης
SLnLn με 1 ισομερές θέσης
PoPoL με 1 ισομερές θέσης
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 106
PPoLn με 2 ισομερή θέσης
OLLn με 2 ισομερή θέσης
PLLn με 2 ισομερή θέσης
PoOLn με 2 ισομερή θέσης
4.5.6.1. TAG με ένα λιπαρό οξύ (LLL, PoPoPo) Βλέπε τύπο (7)
% moles LLL ¼ 9; 205 % � 11; 458 % � 9; 205 %
= 0,09708 mol LLL
% moles PoPoPo ¼ 1; 015 % � 1; 263 % � 1; 015 %
= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TAG με δύο λιπαρά οξέα (PoLL, SLnLn, PoPoL) Βλέπε τύπο (8)
% moles PoLL þ LLPo ¼ 1; 015 % � 11; 458 % � 9; 205 % � 2
= 0,02141
% moles LPoL ¼ 9; 205 % � 1; 263 % � 9; 205 %
= 0,01070
0,03211 mol PoLL
% moles SLnLn þ LnLnS ¼ 4; 327 % � 1; 154 % � 0; 927 % � 2
= 0,00093
% moles LnSLn ¼ 0; 927 % � 0; 177 % � 0; 927 %
= 0,00002
0,00095 mol SLnLn
% moles PoPoL þ LPoPo ¼ 1; 015 % � 1; 263 % � 9; 205 % � 2
= 0,00236
% moles PoLPo ¼ 1; 015 % � 11; 458 % � 1; 015 %
= 0,00118
0,00354 mol PoPoL
4.5.6.3. TAG με τρία διαφορετικά λιπαρά οξέα (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Βλέπε τύπο (9)
% moles PPoLn ¼ 16; 005 % � 1; 263 % � 0; 927 % � 2
= 0,00375
% moles LnPPo ¼ 0; 927 % � 0; 653 % � 1; 015 % � 2
= 0,00012
% moles PoLnP ¼ 1; 015 % � 1; 154 % � 16; 005 % � 2
= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
% moles OLLn ¼ 68; 522 % � 11; 458 % � 0; 927 % � 2
= 0,14577
% moles LnOL ¼ 0; 927 % � 85; 295 % � 9; 205 % � 2
= 0,14577
% moles LLnO ¼ 9; 205 % � 1; 154 % � 68; 522 % � 2
= 0,14577
0,43671 mol OLLn
% moles PLLn ¼ 16; 005 % � 11; 458 % � 0; 927 % � 2
= 0,03400
% moles LnPL ¼ 0; 927 % � 0; 653 % � 9; 205 % � 2
= 0,00111
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 107
% moles LLnP ¼ 9; 205 % � 1; 154 % � 16; 005 % � 2
= 0,03400
0,06911 mol PLLn
% moles PoOLn ¼ 1; 015 % � 85; 295 % � 0; 927 % � 2
= 0,01605
% moles LnPoO ¼ 0; 927 % � 1; 263 % � 68; 522 % � 2
= 0,01605
% moles OLnPo ¼ 68; 522 % � 1; 154 % � 1; 015 % � 2
= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol TAG
▼M13
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 108
Σχήμα 1: Διάγραμμα του log α σε συνάρτηση του f (αριθμός διπλών δεσμών)
Σχήμα: La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure; St = Stearin-
säure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolensäure.
▼M14
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 109
Σχήμα 2: Έλαιο σόγιας
Σχήμα 3: Έλαιο σόγιας/Ελαιόλαδο 30/70
▼M14
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 110
Σχήμα 4: Ελαιόλαδο
▼M14
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 111
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XIX
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ
ΑΛΚΟΟΛΕΣ ΜΕΣΩ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΕΡΙΑΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕ
ΤΡΙΧΟΕΙΔΗ ΣΤΗΛΗ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η μέθοδος περιγράφει διαδικασία προσδιορισμού της περιεκτικότητας
λιπαρών υλών σε αλειφατικές αλκοόλες, απλές και ολικές.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Η λιπαρή ύλη, μετά από προσθήκη 1-εικοσανόλης ως εσωτερικό πρό-
τυπο, σαπωνοποιείται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου και
στη συνέχεια τα ασαπωνοποίητα συστατικά εκχυλίζονται με αιθυλαι-
θέρα. Το κλάσμα των αλκοολών διαχωρίζεται από το εκχύλισμα των
ασαπωνοποιήτων με χρωματογραφία σε βασική πλάκα βασικού διοξει-
δίου του πυριτίου· οι ανακτώμενες από το διοξείδιο του πυριτίου αλκοό-
λες μετατρέπονται σε τριμεθυλοσιλυλαιθέρες και αναλύονται με χρωμα-
τογραφία αέριας φάσης τριχοειδούς στήλης.
3. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
3.1. Σφαιρική φιάλη 250 ml που φέρει κάθετο ψυκτήρα με εσμυρισμένα
άκρα.
3.2. Διαχωριστική χοάνη 500 ml.
3.3. Σφαιρικές φιάλες 250 ml.
3.4. Πλήρης εξοπλισμός για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, με γυάλινες
πλάκες 20 × 20 cm.
3.5. Λυχνία υπεριώδους, μήκους κύματος 366 ή 254 nm.
3.6. Μικροσύριγγες 100 και 500 μl.
3.7. Κυλινδρική διηθητική χοάνη με πορώδη ηθμό G3 (πορώδες 15 έως 40
μm) διαμέτρου περίπου 2 cm και ύψους 5 cm, με κατάλληλο άκρο για
διήθηση υπό κενό και αρσενικό εσμυρισμένο άκρο 12/21.
3.8. Φιάλη κενού των 50 ml με θηλυκό εσμυρισμένο άκρο 12/21 κατάλληλο
για τη διηθητική χοάνη (3.7).
3.9. Σωλήνας με κωνικό πυθμένα, των 10 ml, με πώμα ασφαλείας.
3.10. Χρωματογράφος αέριας φάσης κατάλληλος για λειτουργία με τριχοειδή
στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα κλασμάτωσης, αποτελούμενος από:
3.10.1. Θερμοστατούμενο θάλαμο για τη στήλη, που επιτρέπει τη διατήρηση της
επιθυμητής θερμοκρασίας με ακρίβεια περίπου 1 °C.
3.10.2. Σύστημα έγχυσης με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία και είσοδο από υπερσι-
λανισμένο γυαλί.
3.10.3. Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας και μετατροπέας-ενισχυτής.
3.10.4. Καταγραφέας-ολοκληρωτής κατάλληλος για λειτουργία με μετατροπέα-
ενισχυτή με χρόνο απόκρισης το πολύ ένα δευτερόλεπτο και με μετα-
βλητή ταχύτητα χαρτιού.
3.11. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου,
μήκους 20 έως 30 μέτρων, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm,
καλυμμένη εσωτερικά από υγρό SE-52 ή SE-54 ή ισοδύναμο, με πάχος
μεταξύ 0,10 και 0,30 μm.
3.12. Μικροσύριγγα για χρωματογραφία αέριας φάσης των 10 μl με εσκληρυ-
μένη βελόνη.
3.13. Ζυγός ακριβείας με ευαισθησία 1 mg (με ένδειξη 0,1 mg).
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Υδροξείδιο του καλίου, αιθανολικό διάλυμα περίπου 2 Ν: 130 g υδρο-
ξειδίου του καλίου (ελάχιστου τίτλου 85 %) διαλύονται υπό ψύξη σε
200 ml απεσταγμένου νερού και κατόπιν το διάλυμα συμπληρώνεται
μέχρις όγκου ενός λίτρου με αιθανόλη. Το διάλυμα φυλάσσεται σε γυά-
λινες καλά πωματισμένες αδιαφανείς φιάλες.
4.2. Αιθυλαιθέρας, αναλυτικής καθαρότητας.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 112
4.3. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.4. Γυάλινες πλάκες καλυμμένες με διοξείδιο του πυριτίου χωρίς δείκτη
φθορισμού, πάχους 0,25 mm (διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες για
χρήση).
4.5. Υδροξείδιο του καλίου, αιθανολικό διάλυμα 0,2 N: 13 g υδροξειδίου του
καλίου διαλύονται σε 20 ml απεσταγμένο νερό και το διάλυμα συμπλη-
ρώνεται μέχρις όγκου ενός λίτρου με αιθανόλη.
4.6. Βενζόλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.7. Ακετόνη, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.8. Εξάνιο χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.9. Αιθυλαιθέρας, χρωματογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.10. Χλωροφόρμιο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.11. Διάλυμα αναφοράς για τη χρωματογραφία σε πλάκα: χοληστερόλη ή
φυτοστερόλη, διάλυμα 0,5 % σε χλωροφόρμιο.
4.12. Διχλωρο-2′-7′-φλουορεσκεΐνη, αιθανολικό διάλυμα 0,2 %. Καθίσταται
ελαφρώς βασικό με προσθήκη μερικών σταγονών αλκοολικού διαλύμα-
τος υδροξειδίου του καλίου 2 N.
4.13. Άνυδρη πυριδίνη, χρωματογραφικής καθαρότητας.
4.14. Εξαμεθυλοδισιλαζάνιο.
4.15. Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο.
4.16. Πρότυπα διαλύματα τριμεθυλοσιλυλαιθέρων των αλειφατικών αλκοολών
από C20 έως C28. Πρέπει να παρασκευάζονται τη στιγμή της χρήσης από
μείγματα καθαρών αλκοολών.
4.17. 1-εικοσανόλη, διάλυμα 0,1 % (m/v) σε χλωροφόρμιο (εσωτερικό πρό-
τυπο).
4.18. Φέρον αέριο: καθαρό υδρογόνο ή ήλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.
4.19. Βοηθητικό αέριο: καθαρό άζωτο, για αέρια χρωματογραφία.
5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
5.1. Παρασκευή των ασαπωνοποιήτων
5.1.1. Με τη βοήθεια της μικροσύριγγας 500 μl, εισάγεται στη σφαιρική φιάλη
250 ml διάλυμα 1-εικοσανόλης 0,1 % σε χλωροφόρμιο (4.17) που περιέ-
χει ποσότητα 1-εικοσανόλης που αντιστοιχεί στο 10 % περίπου του
περιεχομένου σε αλειφατικές αλκοόλες στην ποσότητα του προς δοκιμή
δείγματος. Για παράδειγμα, για 5 g δείγματος, πρέπει να προστίθενται
250 μl του διαλύματος 1-εικοσανόλης 0,1 % εάν πρόκειται για δείγμα
ελαιολάδου ή σπορελαίου και 1 500 μl εάν πρόκειται για πυρηνέλαιο.
Ακολουθεί εξάτμιση σε ρεύμα αζώτου μέχρι ξηράνσεως και κατόπιν
ζυγίζονται 5 g ακριβώς ξηρού δείγματος και προστίθενται υπό διήθηση
στην ίδια σφαιρική φιάλη.
5.1.2. Προστίθενται 50 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου
2 N, τοποθετείται ο κάθετος ψυκτήρας και θερμαίνουμε σε ατμόλουτρο
μέχρις ελαφρού βρασμού υπό ταυτόχρονη ζωηρή ανάδευση μέχρις ότου
πραγματοποιηθεί σαπωνοποίηση (το διάλυμα γίνεται διαυγές). Η θέρ-
μανση συνεχίζεται επί είκοσι λεπτά και κατόπιν προστίθενται 50 ml
απεσταγμένο νερό από την κορυφή του ψυκτήρα, ο ψυκτήρας αποσυν-
δέεται και η σφαιρική φιάλη ψύχεται στους 30 °C περίπου.
5.1.3. Το περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης μεταγγίζεται ποσοτικώς σε διαχω-
ριστική χοάνη 500 ml, υποβοηθώντας τη μετάγγιση με την προσθήκη
ποσοτήτων απεσταγμένου ύδατος, χρησιμοποιώντας συνολικά 50 ml.
Προστίθενται περίπου 80 ml αιθυλαιθέρα, η χοάνη ανακινείται ζωηρά
για 30 περίπου δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεμία μέχρι να επέλθει
διαχωρισμός (σημείωση 1).
Η υποκείμενη υδατική φάση διαχωρίζεται συλλέγοντάς την σε άλλη
διαχωριστική χοάνη. Πραγματοποιούνται ακόμη δύο εκχυλίσεις της υδα-
τικής φάσεως, με τον ίδιο τρόπο, χρησιμοποιώντας κάθε φορά 60 έως
70 ml αιθυλαιθέρα.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 113
Σημείωση 1: Τυχόν γαλακτώματα μπορούν να εξαλειφθούν προσθέτο-
ντας με υδροβολέα μικρή ποσότητα αιθυλικής ή μεθυλικής
αλκοόλης.
5.1.4. Τα αιθερικά εκχυλίσματα συγκεντρώνονται σε μία μόνη διαχωριστική
χοάνη και πλένονται με απεσταγμένο νερό (50 ml κάθε φορά) μέχρις
ουδετέρας αντιδράσεως του νερού πλύσεως.
Το νερό πλύσεως απομακρύνεται, το διάλυμα ξηραίνεται με άνυδρο
θειικό νάτριο και διηθείται μέσω ανύδρου θειικού νατρίου σε προζυγι-
σμένη σφαιρική φιάλη 250 ml, εκπλένοντας τη χοάνη και το φίλτρο με
μικρές ποσότητες αιθυλαιθέρα.
5.1.5. Ο αιθέρας αποστάζεται μέχρις ότου να παραμείνει μόνον μια μικρή
ποσότητα και κατόπιν ξηραίνεται υπό ελαφρό κενό ή σε ρεύμα αζώτου,
η ξήρανση ολοκληρώνεται σε ξηραντήριο στους 100 °C επί ένα τέταρτο
της ώρας περίπου, ακολουθεί ζύγιση και έπειτα ψύξη σε ξηραντήρα.
5.2. Διαχωρισμός του αλκοολικού κλάσματος
5.2.1. Ετοιμασία των βασικών πλακών: οι πλάκες διοξειδίου του πυριτίου (4.4)
βυθίζονται πλήρως στο αιθανολικό διάλυμα 0,2 N υδροξειδίου του
καλίου (4.5) επί δέκα δευτερόλεπτα και αφήνονται στη συνέχεια να
στεγνώσουν καλά σε απαγωγό επί δύο ώρες και τοποθετούνται τελικά
σε κλίβανο στους 100 °C επί μία ώρα.
Απομακρύνονται από τον κλίβανο και φυλάσσονται σε ξηραντήρα με
χλωριούχο ασβέστιο μέχρι να χρησιμοποιηθούν (οι πλάκες που έχουν
προετοιμαστεί με αυτό τον τρόπο πρέπει να χρησιμοποιούνται μέσα σε
δεκαπέντε ημέρες).
Σημείωση 2: Η χρήση των βασικών πλακών διοξειδίου του πυριτίου για
το διαχωρισμό του αλκοολικού κλάσματος εξαλείφει την
ανάγκη κατεργασίας των ασαπωνοποιήτων με αλουμίνα.
Με τον τρόπο αυτό, όλες οι ενώσεις όξινου χαρακτήρα
(λιπαρά οξέα και άλλες) συγκρατούνται στη γραμμή ενα-
πόθεσης. Έτσι, η λωρίδα των αλειφατικών και τερπενικών
αλκοολών λαμβάνεται σαφώς διαχωρισμένη από την ταινία
των στερολών.
5.2.2. Στο θάλαμο ανάπτυξης εισάγεται μείγμα εξανίου-αιθυλαιθέρα 65/35
(V/V) μέχρις ύψους περίπου 1 cm (*).
Ο θάλαμος κλείνεται με κατάλληλο καπάκι και αφήνεται έτσι επί μισή
ώρα τουλάχιστον έτσι ώστε να αποκατασταθεί ισορροπία υγρού/ατμού.
Στις εσωτερικές επιφάνειες του θαλάμου είναι δυνατόν να στερεωθούν
λωρίδες διηθητικού χαρτιού που βυθίζονται στο υγρό έκλουσης: με τον
τρόπο αυτό μπορεί να μειωθεί κατά το ένα τρίτο περίπου ο χρόνος
μετατόπισης του μετώπου του υγρού και να επιτευχθεί πλέον ομοιό-
μορφη έκλουση των συστατικών.
Σημείωση 3: Για να έχουμε απολύτως αναπαραγώγιμες συνθήκες έκλου-
σης, το μείγμα πρέπει να αλλάζει σε κάθε δοκιμή.
5.2.3. Παρασκευάζεται διάλυμα 5 % περίπου ασαπωνοποιήτων (5.1.5) σε χλω-
ροφόρμιο και, με τη μικροσύριγγα των 100 μl, αποτίθενται στη χρωμα-
τογραφική πλάκα (5.2.1) σε απόσταση 2 cm περίπου από το ένα χείλος,
0,3 ml του προαναφερθέντος διαλύματος σε μια συνεχή γραμμή, όσο το
δυνατό λεπτότερη και πιο ομοιόμορφη. Στην ευθεία της γραμμής από-
θεσης, σε μια από τις άκρες της πλάκας, φέρονται 2 έως 3 μl του
διαλύματος αναφοράς των αλειφατικών αλκοολών (4.11), για την ταυ-
τοποίηση της λωρίδας των αλειφατικών αλκοολών κατά την τελευταία
ανάπτυξη.
5.2.4. Η πλάκα τοποθετείται στο θάλαμο ανάπτυξης, ο οποίος έχει προετοιμα-
στεί όπως περιγράφεται στο σημείο 5.2.2. Η θερμοκρασία του περιβάλ-
λοντος πρέπει να διατηρείται μεταξύ 15 και 20 °C. Ο θάλαμος κλείνεται
αμέσως με το καπάκι και αφήνεται να επέλθει έκλουση μέχρις ότου το
μέτωπο του διαλύτη να φθάσει περίπου 1 cm από το πάνω χείλος της
πλάκας.
Η πλάκα στη συνέχεια απομακρύνεται από το θάλαμο ανάπτυξης και ο
διαλύτης εξατμίζεται σε ρεύμα θερμού αέρα ή καλύτερα αφήνοντας την
πλάκα να στεγνώσει σε απαγωγό.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 114
(*) Σε ιδαίτερες περιπτώσεις, για να επιτευχθεί καλός διαχωρισμός των λωρίδων πρέπει να
χρησιμοποιηθεί ως μείγμα έκλουσης βενζόλιο-ακετόνη 95/5 (V/V).
5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και ομοιόμορφα με το διάλυμα της διχλωρο-
2′-7′-φλουορεσκεΐνης. Ως λωρίδα των αλειφατικών αλκοολών αναγνωρί-
ζεται εκείνη που είναι στην ίδια ευθεία με την κηλίδα που λαμβάνεται με
το διάλυμα αναφοράς. Με ένα μαύρο μολύβι σημειώνεται το σύνολο της
λωρίδας των αλειφατικών αλκοολών και της αμέσως παραπάνω λωρίδας
που αντιστοιχεί στις τερπενικές αλκοόλες.
Σημείωση 4: Η υπόδειξη για συλλογή του συνόλου της λωρίδας των
αλειφατικών αλκοολών και της λωρίδας των τερπενικών
αλκοολών οφείλεται στο ότι σε αυτή, υπό τις συνθήκες της
μεθόδου, εγκλωβίζονται σημαντικές ποσότητες αλειφατι-
κών αλκοολών.
5.2.6. Με μια μεταλλική σπάτουλα ξύνεται το διοξείδιο του πυριτίου που
περιλαμβάνεται στην οριοθετημένη ζώνη. Το ξύσμα εισάγεται στη
χοάνη διηθήσεως (3.7), προστίθενται 10 ml θερμού χλωροφορμίου, ανα-
μειγνύουμε επισταμένως με τη μεταλλική σπάτουλα και διηθούμε με τη
βοήθεια κενού. Στη συνέχεια το διήθημα συλλέγεται στη φιάλη (3.8), η
οποία είναι συνδεδεμένη με τη χοάνη διηθήσεως.
Το υπόλειμμα στη χοάνη πλένεται τρεις φορές με αιθυλαιθέρα (περίπου
10 ml κάθε φορά) και συλλέγεται όπως και το διήθημα στη συνδεδεμένη
με τη χοάνη διηθήσεως φιάλη (3.8). Το διήθημα εξατμίζεται μέχρις
όγκου περίπου 4 έως 5 ml, το υπολειπόμενο διάλυμα μεταγγίζεται σε
προζυγισμένο σωλήνα 10 ml (3.9), ξηραίνεται θερμαίνοντάς το σε ελα-
φρύ ρεύμα αζώτου, προστίθενται μερικές σταγόνες ακετόνης, ξηραίνεται
εκ νέου, τοποθετείται για δέκα λεπτά περίπου στον κλίβανο στους
105 °C, αφήνεται να ψυχθεί σε ξηραντήρα και ζυγίζεται.
Το υπόλειμμα στο σωλήνα αποτελείται από το κλάσμα των αλειφατικών
αλκοολών.
5.3. Παρασκευή των τριμεθυλοσιλυλαιθέρων
5.3.1. Στο σωλήνα που περιέχει το κλάσμα των αλειφατικών αλκοολών, προ-
στίθεται το αντιδραστήριο σιλυλιώσεως, το οποίο είναι μείγμα πυριδίνης-
εξαμεθυλοδισιλαζάνιου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9/3/1 (V/V/V)
(σημείωση 5) σε αναλογία 50 μl ανά χιλιοστόγραμμο αλειφατικών
αλκοολών, αποφεύγοντας κάθε απορρόφηση υγρασίας (σημείωση 6).
Σημείωση 5: Στο εμπόριο υπάρχουν έτοιμα προς χρήση διαλύματα.
Υπάρχουν και άλλα σιλυλιωτικά αντιδραστήρια όπως
π.χ. το δις-τριμεθυλοσιλυλοτριφθορακεταμίδιο + 1 % τρι-
μεθυλοχλωροσιλάνιο που αραιώνεται με ίσο όγκο άνυδρης
πυριδίνης.
Σημείωση 6: Η ενδεχόμενη εμφάνιση μιας ελαφράς θολότητας είναι
φυσιολογική και δεν εμπνέει καμία ανησυχία. Ένδειξη
παρουσίας υγρασίας ή αλλοίωσης του αντιδραστηρίου
αποτελεί ο σχηματισμός λευκών νιφάδων ή η εμφάνιση
ροζ χρωματισμού. Στην περίπτωση αυτή, η δοκιμή πρέπει
να επαναληφθεί.
5.3.2. Ο σωλήνας πωματίζεται, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς να αναποδογυ-
ριστεί) έως την πλήρη διαλυτοποίηση των αλειφατικών αλκοολών. Αφή-
νεται σε ηρεμία για δεκαπέντε τουλάχιστον λεπτά σε θερμοκρασία περι-
βάλλοντος και κατόπιν φυγοκεντρείται για μερικά λεπτά: το διαυγές
διάλυμα είναι έτοιμο για ανάλυση με αεριοχρωματογραφική ανάλυση.
5.4. Ανάλυση με χρωματογραφία αέριας φάσης
5.4.1. Προκαταρκτικές εργασίες, σταθεροποίηση της στήλης
5.4.1.1. Τοποθετείται η στήλη στο χρωματογράφο αέριας φάσης, συνδέοντας το
άκρο εισόδου με τον εισαγωγέα που είναι συνδεδεμένος με το σύστημα
κλασμάτωσης και το άκρο εξόδου με τον ανιχνευτή. Πραγματοποιούνται
οι εν γένει έλεγχοι που απαιτούνται για μια διάταξη χρωματογραφίας
αέριας φάσης (στεγανότητα του κυκλώματος των αερίων, αποτελεσμα-
τικότητα του ανιχνευτή, αποτελεσματικότητα του συστήματος κλασμά-
τωσης και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.).
5.4.1.2. Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να προηγείται
σταθεροποίηση. Διοχετεύεται ένα ελαφρό ρεύμα φέροντος αερίου διαμέ-
σου της στήλης αυτής, τίθεται σε λειτουργία ο αέριος χρωματογράφος
και αρχίζει μια βαθμιαία θέρμανση μέχρις ότου να φθάσουμε σε μια
θερμοκρασία τουλάχιστον 20 °C πάνω από εκείνη της συνήθους λειτουρ-
γίας (σημείωση 7). Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται για δύο ώρες του-
λάχιστον και κατόπιν η διάταξη φέρεται σε συνθήκες λειτουργίας (ρύθ-
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 115
μιση της ροής του αερίου και του διαχωρισμού, άναμμα της φλόγας,
σύνδεση με τον ηλεκτρονικό καταγραφέα, ρύθμιση της θερμοκρασίας
του θαλάμου για τη στήλη, του ανιχνευτή και του εκκινητήρα κ.λπ.)
και καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχιστον δύο φορές
πάνω από εκείνη που προβλέπεται για την εκτέλεση της ανάλυσης. Το
ίχνος της λαμβανόμενης γραμμής βάσεως πρέπει να είναι γραμμικό,
χωρίς οποιαδήποτε φύσεως κορυφή και δεν πρέπει να παρουσιάζει μετα-
τόπιση. Τυχόν αρνητική ευθύγραμμη μετατόπιση δείχνει ατελή στεγανό-
τητα των συνδέσεων της στήλης, τυχόν θετική μετατόπιση δείχνει ανε-
παρκή σταθεροποίηση της στήλης.
Σημείωση 7: Η θερμοκρασία σταθεροποίησης πρέπει να είναι πάντοτε
κατώτερη κατά 20 °C τουλάχιστον από τη μέγιστη θερμο-
κρασία που προβλέπεται για το χρησιμοποιούμενο υγρό
κατανομής.
5.4.2. Επιλογή συνθηκών εργασίας
5.4.2.1. Οι ενδεικτικές συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:
— θερμοκρασία της στήλης: ισοθερμική έναρξη οκτώ λεπτών στους
180 °C, κατόπιν πρόγραμμα 5 °C ανά λεπτό μέχρι τους 260 °C
και κατόπιν ακόμη δεκαπέντε λεπτά στους 260 °C,
— θερμοκρασία του εξατμιστή: 280 °C,
— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 290 °C,
— γραμμική ταχύτητα του φέροντος αερίου: ήλιο, 20 έως 35 cm ανά
δευτερόλεπτο, υδρογόνο, 30 έως 50 cm ανά δευτερόλεπτο,
— λόγος της διαίρεσης διαχωρισμού: από 1/50 έως 1/100,
— ευαισθησία οργάνου: τετραπλάσια έως 16πλάσια της ελάχιστης εξα-
σθένησης,
— ευαισθησία καταγραφής: 1 έως 2 millivolts στη βασική κλίμακα,
— ταχύτητα του χαρτιού: 30 έως 60 cm ανά ώρα,
— ποσότητα εγχυόμενης ουσίας: 0,5 έως 1 μl διαλύματος TMSE.
Οι συνθήκες αυτές μπορούν να τροποποιούνται ανάλογα με τα χαρακτη-
ριστικά της στήλης και του χρωματογράφου έτσι ώστε να λαμβάνονται
χρωματογραφήματα που να ικανοποιούν τις ακόλουθες συνθήκες:
— ο χρόνος κατακράτησης της αλκοόλης C26 πρέπει να είναι 18 ± πέντε
λεπτά,
— η κορυφή της αλκοόλης C22 πρέπει να είναι 80 ± 20 % της βασικής
κλίμακας για το ελαιόλαδο και για τα σπορέλαια 40 ± 20 % της
βασικής κλίμακας.
5.4.2.2. Για τον έλεγχο των απαιτούμενων ανωτέρω συνθηκών, πραγματοποιού-
νται επανειλημμένες εγχύσεις με τα δείγματα μειγμάτων των TMSE των
αλκοολών και οι λειτουργικές συνθήκες προσαρμόζονται μέχρις ότου
ληφθούν τα καλύτερα αποτελέσματα.
5.4.2.3. Οι παράμετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει να τίθενται κατά
τρόπον ώστε να λαμβάνονται σωστές τιμές για τις εξεταζόμενες κορυ-
φές.
5.4.3. Εκτέλεση της ανάλυσης
5.4.3.1. Λαμβάνεται με τη μικροσύριγγα των 10 μl, 1 μl εξανίου, αναρροφώνται
0,5 μl αέρα και διαδοχικώς 0,5 έως 1 μl του διαλύματος του δείγματος.
Τραβάμε λίγο ακόμη το έμβολο της σύριγγας έτσι ώστε η βελόνα να
κενωθεί. Εισάγουμε τη βελόνα στη μεμβράνη της διάταξης εγχύσεως και
μετά ένα έως δύο δευτερόλεπτα εγχύουμε ταχύτατα, εξάγοντας στη συν-
έχεια αργά τη βελόνα, μετά πέντε δευτερόλεπτα περίπου.
5.4.3.2. Εκτελείται καταγραφή μέχρι πλήρους εκλούσεως των TMSE των υπαρ-
χουσών αλειφατικών αλκοολών. Η γραμμή βάσης πρέπει να πληροί
πάντοτε τις απαιτούμενες συνθήκες (5.4.1.2).
5.4.4. Ταυτοποίηση των κορυφών
Η ταυτοποίηση των μεμονωμένων κορυφών πραγματοποιείται βάσει των
χρόνων κατακράτησης και διά συγκρίσεως με το μείγμα των TMSE των
αλειφατικών αλκοολών, με ανάλυση υπό τις ίδιες συνθήκες.
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 116
Η εικόνα 1 δείχνει χρωματογράφημα του αλκοολικού κλάσματος ενός
παρθένου ελαιολάδου.
5.4.5. Ποσοτικός προσδιορισμός
5.4.5.1. Προβαίνουμε με τον ολοκληρωτή στον υπολογισμό του εμβαδού των
κορυφών της 1-εικοσανόλης και των αλειφατικών αλκοολών C22, C24,
C26 και C28.
5.4.5.2. Η περιεκτικότητα σε κάθε μεμονωμένη αλειφατική αλκοόλη υπολογίζε-
ται σε χιλιοστόγραμμα για 1 000 γραμμάρια λιπαρής ύλης, ως εξής:
όπου:
Ax = εμβαδόν της κορυφής της αλκοόλης x
As = εμβαδόν της κορυφής της 1-εικοσανόλης
ms = βάρος προστιθέμενης 1-εικοσανόλης, σε χιλιοστόγραμμα
m = βάρος ληφθέντος δείγματος για τον προσδιορισμό, σε γραμμά-
ρια.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Οι περιεκτικότητες των μεμονωμένων αλειφατικών αλκοολών αναφέρο-
νται σε χιλιοστόγραμμα για 1 000 γραμμάρια λιπαρής ύλης και το άθροι-
σμά τους ως «συνολικές αλειφατικές αλκοόλες».
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 117
ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ
Προσδιορισμός της γραμμικής ταχύτητας του αερίου
Στο χρωματογράφο αέριας φάσης, ρυθμισμένο σε φυσιολογικές συνθήκες λει-
τουργίας, εγχύονται 1 έως 3 μl μεθανίου (ή προπανίου) και μετράται ο χρόνος
που χρειάζεται το αέριο να διασχίσει τη στήλη, μεταξύ της στιγμής εγχύσεως και
εκείνης της εξόδου της κορυφής (tM).
Η γραμμική ταχύτητα σε εκατοστόμετρα ανά δευτερόλεπτο δίδεται από τον τύπο
L/tM, όπου L είναι το μήκος της στήλης σε εκατοστόμετρα και tM ο μετρού-
μενος χρόνος σε δευτερόλεπτα.
Εικόνα 1 — Χρωματογράφημα του αλκοολικού κλάσματος ενός παρθένου
ελαιολάδου
1 = Εικοσανόλη
2 = Εικοσιδυανόλη
3 = Εικοσιτριανόλη
4 = Εικοσιτετρανόλη
5 = Εικοσιπεντανόλη
6 = Εικοσιεξανόλη
7 = Εικοσιεπτανόλη
8 = Εικοσιοκτανόλη
▼M19
1991R2568— EL— 01.01.2008— 021.001— 118